丹參素衍生物ADTM對肝小靜脈閉塞綜合征作用研究

林依涵　葉倩茹　沈彥伶　泮艷璐　馮芝怡　陳磊

【摘 要】目的：通過建立土三七誘導小鼠肝小靜脈閉塞綜合征模型，探索丹參素衍生物ADTM對肝小靜脈閉塞綜合征的作用。方法：建立土三七提取液誘導小鼠肝小靜脈閉塞綜合征模型，除對照組外，其余各組給予土三七濃縮提取液（15g/kg/d），同時給藥組給予ADTM（60mg/kg/d），對照組給予同體積賦型劑，連續給藥四周。采用生化法檢測轉氨酶和血脂，采用蘇木素-伊紅染色（HE）檢測肝臟病理組織學改變。結果：與對照組比較，模型組小鼠血清谷丙轉氨酶（ALT）和門冬氨酸氨基轉移酶（AST）顯著性升高，血清甘油三酯（TG）顯著性降低，總膽固醇（CHO）無明顯變化，肝組織肝竇充血嚴重，肝血竇間隙變小，肝血竇內皮細胞增生，kuffer細胞增生。給藥組血清轉氨酶沒有降低，TG顯著性升高，病理改變明顯減輕。結論：土三七提取液可引起小鼠肝小靜脈閉塞綜合征，ADTM對土三七所誘導的肝小靜脈閉塞綜合征有明顯的改善作用。

【關鍵詞】土三七;吡咯烷生物堿;肝小靜脈閉塞綜合征;藥物性肝損害

中圖分類號： R284;R285文獻標識碼： A 文章編號： 2095-2457（2019）36-0264-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.36.125

肝小靜脈閉塞征（Hepatic venular occlusive disease ， HVOD）是指由多種原因導致的非血栓性肝小靜脈狹窄和閉塞，從而引起肝內竇后門靜脈高壓的肝血管性疾病[1]。據研究證明，引起該病的原因多由于攝入過多植物中的吡啶類生物堿。目前，已得到實驗證實的含吡啶類生物堿植物有土三七、狗舌草、一點紅等[2]。在以往的研究中，我們發現關于治療肝小靜脈閉塞綜合征的藥物十分有限，并且沒有特效的治療藥物，目前臨床上對于肝小靜脈閉塞綜合征的治療主要以對癥治療為主[3]，多采用支持療法，抗凝、祛聚療法，促進肝細胞再生藥物治療法等。

已有文獻報道，丹參對土三七所致肝小靜脈閉塞綜合征有明顯的預防治療作用，在丹參預防治療組中，肝竇纖維化及中央靜脈內膜纖維化較土三七模型組少，病變程度明顯輕于模型組，沒有明顯的肝小靜脈閉塞綜合征表現[4]。由此可見，丹參對于治療肝小靜脈閉塞綜合征具有一定的預防作用，且根據其實驗中給藥劑量的不同，也顯示出不同的給藥劑量對肝小靜脈閉塞綜合征的預防有不同程度的效果。

丹參素衍生物ADTM是由丹參素（DSS）與活性分子川芎嗪（TMP）結合得到的化合物。鑒于ADTM對于血管內皮細胞的作用顯著，本實驗嘗試在動物水平上研究ADTM對土三七誘導的肝小靜脈閉塞綜合征的作用，一方面可為ADTM的臨床應用提供依據，另一方面可為開發或者篩選治療肝小靜脈閉塞綜合征的藥物提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

ICR小鼠84只，雄性，體重22～24g，SPF級，購自浙江省醫學科學院，許可證號：SCXK（浙）2014-0001。小鼠飼養于恒溫恒濕屏障動物房內。每日明暗時長各12小時，標準飼料，自由飲水。

1.2 主要試劑與儀器

土三七購自亳州市九康藥業銷售有限公司;丹參衍生物ADTM由暨南大學提供;甘油三酯、膽固醇、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶測定試劑盒均購自北京北化康泰臨床試劑有限公司;超聲波清洗器（上海知信實驗儀器技術有限公司）、生化分析儀（北京普朗有限公司）、離心機（長沙維爾康湘鷹離心機有限公司）、電子天平（奧豪斯儀器有限公司）。

1.3 土三七提取液制備和ADTM溶液配制

先取1000g土三七加水浸泡2h，將電磁爐調1300瓦進行加熱煎煮，等到藥液開始沸騰后降低功率至120瓦繼續加熱1.5h。用過濾器濾出藥液，得到藥液a，然后再次加3000ml的水用上述方法進行煎煮1.5h，濾出得到藥液b，將濾液a和b混合，然后進行加熱濃縮至500ml，最后放進冰箱冷藏備用。

1.4 動物分組與給藥

動物適應一周后隨機分為6組：正常對照組（10只）、土三七模型組（23只）、ADTM治療組（22只），5只/籠飼養，每天更換水瓶，每2天更換1次墊料。ADTM治療組每天灌胃ADTM溶液60mg/kg/d，1h后，再灌胃土三七提取液15g/kg/d;模型組每天灌胃同體積賦型劑60mg/kg/d，1h后，再灌胃土三七提取液15g/kg/d;正常對照組給予同體積賦型劑。

1.5 血樣和肝組織處理

取血量需達到1ml以上，取血靜置30min，置于離心機4℃/4500rpm/離心10min，吸取上層血清放入1.5ml EP管內，并存于冰箱冷凍。用手術剪取每只小鼠肝臟大葉同一部位三角狀組織，放于含有10%中性福爾馬林的試管中固定，留作病理檢測。剩余的肝組織用生獨立包裝于-80℃冰箱儲存。

1.6 生化法測定血清轉氨酶和血脂

按照試劑盒說明書指示，利用生化分析儀測定血清丙氨酸轉氨酶（ALT）和天冬氨酸轉氨酶（AST）的數值分析肝臟損傷情況，通過測定血清中甘油三酯（TG）和膽固醇（CHO）含量分析小鼠血脂的情況。

1.7 肝臟病理組織學檢查

取肝組織經10%中性福爾馬林溶液固定后做病理切片。酒精梯度脫水，常規石蠟包埋，連續切片（厚度約5μm），經HE染色后，光學顯微鏡下觀察肝組織病理學改變。根據肝臟病變程度進行評分。

1.8 統計學分析

采用SPSS13.0統計軟件處理分析數據，采用SNK q檢驗對各組同一時間點的同一指標進行比較，實驗數據以均數±標準差（Mean±SD）表示，P<0.05具有統計學意義。

2 結果

2.1 ADTM對肝小靜脈閉塞綜合征小鼠體重的影響

小鼠灌胃28天后，土三七模型組體重增加明顯，毛發稀疏，食量明顯減退，活動明顯減少，腹腔腫大，剖腹后可見半透明腹水，試驗期間小鼠死亡17只。各組小鼠實驗前后體重都有明顯增長。與正常組比較，模型組和給藥組體重增長幅度較小。與模型組比較，給藥組體重略大，體重個體差異較明顯（表1）。

表1 各組實驗小鼠實驗前后體重分析

2.2 ADTM對肝小靜脈閉塞綜合征小鼠血清轉氨酶水平的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠血清ALT和AST均顯著性升高，分別為正常對照組的2.5倍和1.3倍，而ADTM給藥組小鼠血清轉氨酶ALT和AST并沒有顯著性下降（表2）。

表2 ADTM對肝小靜脈閉塞綜合癥小鼠血清轉氨酶水平的影響

（注：n=10，mean±SD;###P<0.001vs.正常組）

2.3 ADTM對肝小靜脈閉塞綜合征小鼠血脂水平的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠血清TG明顯降低，為對照組的63%，模型組血清CHO沒有改變。ADTM給藥組小鼠血清TG明顯升高，CHO也沒有改變（表3）。

表3 ADTM對肝小靜脈閉塞綜合癥小鼠血脂水平

的影響

（注：n=10，mean±SD;###P<0.001vs.正常對照組;*P<0.05vs.土三七模型組）

2.4 ADTM對肝小靜脈閉塞綜合征小鼠肝組織病理學改變的影響

正常對照組小鼠肝小葉結構正常，肝細胞排列緊密，細胞繞中央靜脈呈放射狀排列，未見肝細胞脂肪變性、壞死。Kuffer細胞無明顯增生，匯管區局部炎癥細胞浸潤。肝血竇正常，未見淤血、下狹窄或閉塞。未見明顯纖維化，中央靜脈未見狹窄;模型組小鼠肝小葉結構破壞，部分肝細胞核固縮，匯管區可見炎細胞堆積，部分匯管區纖維化，部分肝細胞脂肪變性，肝竇充血嚴重，肝血竇間隙變小，肝血竇內皮細胞增生，kuffer細胞增生。ADTM給藥組小鼠肝病理改變比模型組明顯減輕（表4、圖1）。

表4 ADTM對肝小靜脈閉塞綜合癥小鼠肝臟病理分析

（注：—：陰性;+：陽性，+的個數表示陽性的程度）

圖1 ADTM對肝小靜脈閉塞綜合癥小鼠肝臟

病理切片圖

3 討論

丹參是我國傳統醫學中應用最廣泛的藥物，其主要成分丹參素（DSS）是抗心腦缺血損傷的主要活性物質。為了提高丹參素的療效，充分發揮其治療特色，對丹參素進行了系統的化學結構修飾。經過大量的藥效與藥理學的研究，發現丹參素（DSS）與活性分子川芎嗪（TMP）結合得到的化合物ADTM對血管內皮細胞療效顯著。

本研究首先建立土三七誘導肝小靜脈閉塞綜合征模型，即連續灌胃土三七提取液15g/kg/d四周，模型組小鼠血清轉氨酶ALT和AST水平顯著性升高、血脂TG水平顯著降低，而CHO無明顯變化，肝小葉放射狀排列結構破壞，肝細胞脂肪變性，肝竇充血嚴重，肝血竇間隙變小，部分狹窄、閉塞，肝血竇內皮細胞增生，kuffer細胞增生，匯管區可見纖維化。上述改變與以往研究一致[5]，均可反映出灌胃給藥土三七提取液引起小鼠肝小靜脈閉塞。丹參素衍生物ADTM（30mg/kg/d）給藥對血清轉氨酶ALT和AST升高并沒有抑制，但可明顯緩解TG的下降，并能明顯減輕小鼠肝病理組織學改變，表明土三七提取液可引起小鼠肝小靜脈閉塞綜合征，ADTM對土三七所誘導的肝小靜脈閉塞綜合征有明顯的改善作用。

已有的研究表明，在土三七已發現超過5種吡咯烷生物堿[6]，其中3種具有較強肝毒性：千里光寧、千里光非寧和全緣千里光堿，可有效致小鼠肝小靜脈閉塞綜合征。大量的實驗研究表明川芎嗪、低分子肝素、激素等藥物可有效地緩解小鼠肝小靜脈閉塞綜合征的癥狀[7-10]，可以確定這些藥物對肝小靜脈閉塞綜合癥有一定的療效。通過本項目研究，土三七對肝小靜脈閉塞綜合征確實有誘導作用，可使小鼠血清轉氨酶ALT和AST明顯升高、血脂TG顯著降低，ADTM對肝小靜脈閉塞綜合征有改善作用，但作用機制尚不明確，本實驗可為丹參素衍生物ADTM的臨床應用與開發提供實驗數據。

【參考文獻】

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