狼瘡性腎炎患者尿液和腎組織Podocin、Nephrin蛋白表達及其與足細胞損傷的關系

閆喜惠，郭鵬，楊挺，孫冬旋

(北華大學附屬醫院，吉林吉林132000)

系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種累及多系統的自身免疫性疾病，其病因及發病機制尚不明確，大多數患者均存在不同程度的腎臟受累，50%～60%的患者可出現狼瘡性腎炎(LN)，其嚴重程度直接影響SLE的預后[1,2]。既往研究認為，LN所致蛋白尿與血尿是由毛細血管內增生及免疫復合物沉積引起的濾過屏障破壞的結果，但最近越來越多的研究發現，部分LN患者可伴有以足突融合、足突寬度增加為主要表現的足細胞損傷，足細胞相關分子表達異常在LN的發生發展過程中發揮著重要作用[3]。足突蛋白(Podocin)、腎病蛋白(Nephrin)均為新近發現的足細胞裂孔膜蛋白組分，與腎小球濾過屏障功能密切相關，研究證實二者表達異常是導致腎臟疾病蛋白尿形成的主要因素，但其在LN發病中的作用尚不明確[4]。2016年1月～2017年12月，我們觀察并分析了LN患者腎組織Podocin和Nephrin蛋白的表達變化，探討其與足細胞損傷的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期在我院腎病風濕科門診就診的LN患者62例作為LN組，男24例、女38例，年齡19～55(35.8±5.7)歲，病程5個月～9.1年、平均3.1年，根據內生肌酐清除率(Ccr)評價腎功能損害程度[5]，將LN組分為輕度損傷27例(Ccr為51～70 mL/min)、中度損傷19例(Ccr為31～50 mL/min)、重度損傷16例(Ccr<30 mL/min)。納入標準：均符合1997年美國風濕病協會(ACR)制定的LN診斷標準，并經臨床、實驗室檢測及腎活檢病理確診；排除腎小球腎炎、IgA腎病等其他腎臟疾病；排除腫瘤、感染及心、肺、肝等系統嚴重功能障礙。選擇確診為SLE且無腎臟損害者60例作為SLE組，男23例、女27例，年齡21～50(35.2±4.8)歲，病程4個月～8.7年、平均3.3年。選擇同期在本院健康體檢者60例作為對照組，男30例、女30例，年齡18～50(34.4±4.6)歲。各組性別、年齡等基本資料比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 足細胞損傷評價方法

1.2.1 各組24 h尿蛋白定量檢測 留取各組24 h尿液，采用改良雙縮脲法檢測24 h尿蛋白定量，儀器為貝克曼AU580全自動生化分析儀。

1.2.2 各組尿足細胞數量檢測 留取各組清晨中段尿液25 mL，1 500 r/min離心5～10 min，棄上清，取沉渣加入0.1 mL生理鹽水充分混勻。利用熒光顯微鏡，先在低倍鏡下觀察全片，再切換至高倍鏡下，選擇左上、左下、右上、右下和中間5個不同部位20個高倍視野(HP)確認足細胞并攝像，記錄形態完整的足細胞數量。

1.3 各組尿Podocin、Nephrin 排泄濃度測定 留取各組清晨中段尿液25 mL，1 500 r/min離心5～10 min，棄上清，將尿沉渣置于計數板，干燥后用4%甲醛固定15 min。采用酶聯免疫法測定尿Podocin和Nephrin排泄濃度，試劑盒購自美國Biosource公司，根據標本OD值計算樣品的實際濃度。

1.4 LN組腎組織足細胞Podocin、Nephrin蛋白表達檢測 LN組在超聲引導下實施腎穿刺活檢術，采用免疫組化法檢測腎組織足細胞Podocin、Nephrin蛋白表達。腎臟組織常規石蠟切片脫蠟至水，抗原修復，10%正常羊血清封閉10 min，經PBS充分洗滌后加入羊抗人Podocin、Nephrin多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，4 ℃孵育過夜。次日PBS洗滌后滴加FITC標記的驢抗羊多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，37 ℃避光水浴1 h。封片后在熒光顯微鏡下觀察，通過雙通道熒光集成圖像觀察腎組織中足細胞Podocin、Nephrin蛋白表達。

2 結果

2.1 各組24 h尿蛋白定量、尿足細胞數量及尿Podocin、Nephrin排泄濃度比較 與SLE組、對照組比較，LN組24 h尿蛋白定量、尿足細胞數量、尿Podocin及Nephrin排泄濃度均升高(P均<0.05)；SLE組上述指標均高于對照組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組24 h尿蛋白定量、尿足細胞數量及尿Podocin、Nephrin排泄濃度比較

2.2 LN組不同腎功能損害程度患者腎組織Podocin、Nephrin蛋白表達比較 腎功能損害程度較重者腎組織Podocin、Nephrin蛋白表達均較低(P均<0.05)。見表2。

表2 LN組不同腎功能損害程度患者Podocin、Nephrin蛋白表達比較

2.3 LN患者24 h尿蛋白量與足細胞相關指標間的相關性 LN患者24 h尿蛋白量與尿Podocin排泄濃度(r=0.433)、尿Nephrin排泄濃度(r=0.407)均呈正相關，而與腎組織Podocin蛋白(r=-0.501)、Nephrin蛋白(r=-0.497)表達均呈負相關(P均<0.05)。

2.4 LN患者尿Podocin、Nephrin排泄濃度與腎組織Podocin、Nephrin蛋白表達的相關性 LN患者尿Podocin排泄濃度與腎組織Podocin蛋白表達呈負相關，尿Nephrin排泄濃度與腎組織Nephrin蛋白表達呈負相關(r分別為-0.463、-0.502，P均<0.05)。

3 討論

SLE腎臟受累是導致患者死亡的主要原因之一。LN的臨床表現多樣，從無癥狀血尿或蛋白尿至管型尿，甚至慢性腎衰竭，上述變化與腎臟病理損傷的多樣性相關。研究發現，足細胞損傷及足細胞相關分子的異常表達直接影響LN的發病及病情發展[6]。足細胞是一種從細胞體延伸出突起的高度分化的細胞，位于腎小球毛細血管外側，相鄰的足細胞突起彼此交錯，形成網狀結構覆蓋于腎小球毛細血管壁，在尿液形成時防止蛋白的滲漏方面起了重要的作用[7]。足細胞的損傷與蛋白尿的產生互為因果、相互影響，狼瘡足細胞病是近年來才逐漸被認識的一種特殊類型的LN[8]。LN早期初始階段足細胞數目通常是正常的，白蛋白排泄量也在正常范圍，但隨著微量白蛋白的出現，足細胞數目逐漸減少，并合并結構功能改變，網狀結構完整性受到破壞，導致蛋白尿的排泄量增加，而大量蛋白尿又進一步加重足細胞損傷，構成惡性循環[9]。

Podocin、Nephrin均是足細胞相關蛋白，前者屬于跨膜蛋白，特異性表達于裂孔隔膜上，后者屬于完整膜蛋白，定位于足突裂孔膜伸入足突膜的位置。近期研究表明，足細胞Podocin、Nephrin蛋白分子共同形成裂孔隔膜復合體，連接足突形成裂孔隔膜，被視為腎小球大分子蛋白濾過的最后屏障[10,11]。最近Szeto等[13]研究顯示，在活動性LN患者尿液中Podocin mRNA及Nephrin mRNA表達明顯升高，且與24 h尿蛋白定量及狼瘡活動指數呈正相關，尿液中Podocin mRNA的表達增強亦與狼瘡活動指數呈正相關，但目前關于腎組織中Podocin、Nephrin的表達變化研究仍較少。本研究結果顯示，與SLE組、對照組比較，LN組24 h尿蛋白定量、尿足細胞數量、尿Podocin及Nephrin排泄濃度均升高，表明LN患者腎臟足細胞損傷與蛋白尿較重，檢測尿足細胞有助于了解腎臟功能狀態及疾病進展[12]；24 h尿蛋白量與尿Podocin排泄濃度、尿Nephrin排泄濃度均呈正相關，而與腎組織Podocin蛋白、Nephrin蛋白表達均呈負相關，提示尿Podocin、Nephrin排泄濃度可作為足細胞損傷和衡量尿蛋白的指標。

Sun等[14]研究顯示，LN疾病早期足突與裂孔膜尚未被破壞的情況下，Nephrin表達就已開始減少，由此推測Nephrin蛋白丟失早于裂孔膜結構的改變。本研究結果顯示，腎功能損害程度較重者腎組織Podocin、Nephrin蛋白表達均較低，提示隨著LN腎功能損傷程度的增加，更多損傷的足細胞與基底膜分離，脫落進入尿液，導致腎臟Podocin、Nephrin蛋白的表達量依次降低，表明腎組織Podocin、Nephrin蛋白表達情況有助于反映腎臟的微小病理改變。本研究結果顯示，尿Podocin排泄濃度與腎組織Podocin蛋白表達呈負相關，尿Nephrin排泄濃度與腎組織Nephrin蛋白表達呈負相關，表明尿、腎臟足細胞Podocin、Nephrin具有良好的相關性，尿Podocin、Nephrin排泄濃度可作為LN患者足細胞損傷的無創傷性評估指標。

綜上所述，LN患者尿Podocin、Nephrin排泄濃度明顯升高，而腎組織Podocin、Nephrin蛋白表達明顯降低，且均與24 h尿蛋白定量密切相關，可反映足細胞的損傷程度。進一步深入研究Podocin、Nephrin的表達在LN蛋白尿中的作用機制，有望為LN探尋新的治療靶點。