桂枝去桂加茯苓白術湯對膿毒癥性大鼠腎損傷的影響及機制

谷翠芝，謝敏慧，唐余廣，曾凝，劉仕，覃源，葉祖楊 ，李清初

(1桂林醫學院，廣西桂林541004；2桂林醫學院附屬醫院；3鹽城市第三人民醫院)

膿毒癥是一種主要由感染引起的全身炎癥反應綜合征，膿毒癥患者常出現膿毒癥性急性腎損傷(SAKI)，可明顯增加患者的病死率[1]。雖然抗感染治療和器官支持療法已普遍應用于SAKI的治療，但治療效果仍有待提高。《傷寒論》為我國傳統醫學的經典著作，書中敘述桂枝去桂加茯苓白術湯治療的病癥為：太陽病，服桂枝湯，或下之，仍頭項強痛，翕翕發熱，無汗，心下滿，微痛，小便不利者，桂枝去桂加茯苓白術湯主之。從上述病癥看，有發熱、尿少、血容量不足的特點，與感染所致的急性腎損傷有相同表現，為桂枝去桂加茯苓白術湯應用治于SAKI的治療提供了可能。我們在臨床治療中發現，加用桂枝去桂加茯苓白術湯治療SAKI患者，血清肌酐(Cr)下降較常規抗感染治療更顯著[2]。但其對SAKI的機制尚不明確。2017年3月～2018年3月，我們觀察了桂枝去桂加茯苓白術湯對膿毒癥大鼠腎功能的影響，并探討其機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 8～10周齡SPF級雄性SD大鼠32只，體質量(240±20)g，購自桂林醫學院實驗動物飼養中心。適應性喂養1周，自由飲食，室溫22～25 ℃，濕度40%～60%，狀態良好。大鼠中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)定量ELISA試劑盒(武漢華美生物)；DAB顯色試劑盒(邁新試劑)；山羊抗小鼠/兔IgG聚合物(北京中杉金橋生物技術有限公司)；NF-κB與TNF-α免疫組化試劑盒(武漢博士德生物制品有限公司)；羅氏COBASC501全自動生化分析儀[羅氏診斷產品(上海)有限公司] ；BX53顯微鏡及成像系統(OLYMPUS)；ST-360酶標儀(上海科華實驗系統有限公司)。

1.2 藥汁制備 根據藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算表[3]，換算桂枝去桂加茯苓白術湯劑量。低劑量桂枝去桂加茯苓白術湯：芍藥9 g、甘草6 g、生姜9 g、白術9 g、茯苓9 g、大棗3枚。高劑量桂枝去桂加茯苓白術湯：芍藥42 g、甘草28 g、生姜42 g、白術42 g、茯苓42 g、大棗12枚。藥物煎制方法：將全部藥物用水浸沒泡30 min，水至少要浸沒全部藥物，大火加熱，沸騰后改小火煎30 min，瀝盡藥汁；第二次加水浸沒藥物，同法煎后，將兩次藥汁混合。將藥汁加熱濃縮至150 mL，高劑量桂枝去桂加茯苓白術湯生藥劑量為2.22 g/藥汁1 mL，低劑量桂枝去桂加茯苓白術湯生藥劑量為1.27 g/藥汁1 mL。

1.3 動物分組及膿毒癥模型制備 將大鼠按隨機數字表法分為假手術組(S組)、盲腸結扎穿孔術模型組(CLP組)、桂枝去桂加茯苓白術湯高劑量組(G組)與桂枝去桂加茯苓白術湯低劑量組(D組)，每組8只。CLP組、G組和D組采用盲腸結扎+穿孔法制作膿毒癥模型，大鼠術前12 h禁食不禁水，10%水合氯醛(3 g/kg)腹腔注射，麻醉后仰臥位固定于手術板上，沿中下腹中線備皮，于中下腹中線右旁開作長約1 cm縱行切口，找到盲腸后小心游離盲腸末端，距回盲瓣末端約1 cm處結扎盲腸，避免結扎盲腸和回腸系膜血管，用18號注射器針頭穿孔2個，擠出腸內容物約0.5 mL入腹腔，還納盲腸，逐層縫合切口。術后腹腔注射37 ℃生理鹽水40 mg/kg預防循環衰竭。手術過程保持室溫25 ℃左右，術后大鼠單籠飼養，用白熾燈照射大鼠，使其肛溫維持在(37±1)℃，直到動物清醒。S組同法打開腹腔、找到盲腸后，不進行盲腸結扎+穿孔。

1.4 干預方法 術后1.5、6、12 h時，G組、D組均分別給予高劑量及低劑量桂枝去桂加茯苓白術湯灌胃，S組與CLP組在同樣時間段均灌胃等劑量生理鹽水。術后自由飲水與進食。

1.5 一般情況及腹腔情況觀察 觀察各組大鼠飲水、進食、呼吸、心率、眼角分泌物、精神狀態、皮溫等一般情況。術后24 h麻醉處死大鼠，解剖腹腔，觀察腹腔氣味、腸粘連、腹水、盲腸末端結扎部位壞死等情況。

1.6 血清Cr、尿素氮(BUN)、NGAL水平檢測 術后24 h經心臟穿刺取血，靜置2 h后4 ℃、4 000 r/min離心5 min，取血清經全自動生化分析儀檢測Cr、BUN水平。采用酶聯免疫吸附測定法檢測血清NGAL水平。

1.7 腎組織病理改變觀察 處死大鼠后取腎組織，4%多聚甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋，3 μm切片，采用HE染色觀察各組腎組織病理改變。

1.8 腎組織NF-κB、TNF-α蛋白表達檢測 采用免疫組織化學法。取腎組織，制備石蠟切片，每張切片隨機取5個位于腎皮質與腎髓質交界區的不互相重復的高倍視野，通過Image-Pro Plus圖像處理軟件計算出每個視野的光密度(OD)值，再取平均值，分析比較各組大鼠NF-κB和TNF-α的OD值。

2 結果

2.1 各組一般情況比較 S組大鼠術后15 min左右蘇醒，可自由活動，進食飲水正常，眼角無或少量分泌物，無死亡。CLP組大鼠術后30 min左右蘇醒，精神萎靡、嗜睡，少飲食飲水，眼角較多分泌物，皮溫升高，呼吸急促，心率增快，在術后12～24 h死亡4只；G組與D組各項癥狀均較S組加重、較CLP組減輕，術后24 h G組大鼠全部存活，D組死亡2只。

2.2 各組腹腔情況比較 S組腹腔內結構清晰，無惡臭，胃腸管表面濕潤光滑。CLP組腹腔內見較多血性腹水，可聞及惡臭味，腸管結構不清，充血水腫，嚴重粘連，盲腸末端結扎部發黑。G組和D組大鼠腹腔結構較清晰，有少量腸管粘連，可聞及臭味，盲腸末端結扎部位呈暗紅色。

2.3 各組血清Cr、BUN及NGAL水平比較 CLP組、G組、D組血清Cr、BUN及NGAL水平均高于S組，G組、D組血清Cr、BUN及NGAL水平均低于CLP組，G組血清Cr、BUN及NGAL水平均低于D組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組血清Cr、BUN及NGAL水平比較

2.4 各組腎組織病理改變比較 S組腎臟組織結構完整清晰，未見管型，間質無炎性細胞浸潤，腎小管上皮細胞胞質染色均勻，胞核居中，未見空泡樣變性、凋亡與壞死。CLP組部分腎小管結構破壞，出現斷裂或塌陷，腔內可見管型，大量腎小管上皮細胞水腫、空泡樣變性、胞核固縮邊集，間質有較多炎性細胞浸潤。G組與D組腎臟組織損害較CLP組減輕。見圖1。

2.5 各組腎組織NF-κB、TNF-α蛋白表達比較 CLP組腎組織NF-κB、TNF-α蛋白表達均高于S組，G組、D組腎組織NF-κB、TNF-α蛋白表達均低于CLP組，G組腎組織NF-κB、TNF-α蛋白表達均低于D組(P均<0.05)。見表2。

3 討論

膿毒癥是一種全身化膿性疾病，是指化膿性細菌或致病菌毒素從感染部位浸入血液，并大量繁殖，通過血液循環系統浸入到患者其他組織器官，而引起的全身炎癥反應綜合征。其臨床治療在抗感染和支持療法上取得了很大的改善，但患者的病死率仍然高達30%～70%[4]。有研究表明，ICU發生急性腎損傷的患者，其中47.5%的病因是膿毒癥；與非膿毒癥引起的急性腎損傷患者相比，膿毒癥并發急性腎損傷患者的住院病死率明顯增高，膿毒性休克是AKI的獨立致病因素[5]。

注：A為S組，B為GLP組，C為G組，D為D組。

表2 各組腎組織NF-κB、TNF-α蛋白表達比較

通過CLP建立膿毒癥模型被認為是建立膿毒癥模型的金標準，其病理生理過程與人的膿毒癥病理生理過程相似，在造模后6～12 h會發生臟器功能障礙[6]。本研究應用此方法制備急性腎損傷動物模型，術后24 h見CLP組大鼠術后精神萎靡、嗜睡，皮溫升高，呼吸急促，心率增快，4只死亡，存活大鼠腹腔較多血性腹水，可聞及惡臭味，腸管充血水腫、嚴重粘連，盲腸末端結扎部發黑，血清Cr、BUN水平均高于S組，腎組織病理檢查見部分腎小管結構破壞，腔內見管型，大量腎小管上皮細胞水腫、空泡樣變性、胞核固縮邊集，間質有較多炎性細胞浸潤，提示術后24 h模型大鼠均出現腎臟功能與形態結構的損害，表明膿毒癥在短時間內可導致急性腎損傷的發生。

桂枝去桂加茯苓白術湯由芍藥、炙甘草、生姜、白術、茯苓和大棗組成，方劑功效為利水通陽。動物實驗表明，桂枝去桂加茯苓白術湯在用藥后有明顯的利尿作用[7]。我們曾在研究中藥方劑抗腎小球硬化時發現，腎氣湯、健脾益腎湯能有效減輕腎小球硬化大鼠的腎小球與腎小管損害，這些方劑中有桂枝湯的共同組分如茯苓、白術、芍藥、甘草等[8,9]。研究發現，白術茯苓加厚撲、枳實等可降低脾虛型克羅恩病大鼠結腸黏膜細胞TNF-α、IL-1β的水平，減輕炎癥反應[10]。本研究發現，G組、D組各項癥狀及腹腔病變程度較CLP組減輕，腎臟組織損害較CLP組減輕，血清Cr、BUN水平均低于CLP組，且G組血清Cr、BUN水平均低于D組，提示該方劑能改善膿毒癥對腎組織的損傷，減輕腎功能損害，且高濃度給藥效果優于低濃度給藥，可能延長SAKI的遠期存活率[11]。

NGAL由人類中性粒細胞分泌，和明膠酶B共價結合形成異二聚體蛋白，相對分子量25 kDa。正常情況下，NGAL可促進腎祖細胞往腎小管上皮細胞分化，維持腎組織正常發育。當機體出現炎癥反應時，NGAL高表達，這是一種代償反應，既可提示腎損傷程度，又對機體有一定的保護作用。新近研究認為，NGAL是急性腎損傷早期生物標志物，具有高靈敏性和特異性[12]。本研究發現，G組、D組血清NGAL水平均低于CLP組，G組血清NGAL水平均低于D組，各組NGAL水平與腎功能損害程度趨勢一致，提示NGAL可在急性腎損傷早期反映腎功能的變化，桂枝去桂加茯苓白術湯治療能降低SAKI大鼠的NGAL水平。

研究認為，膿毒癥主要通過引起機體嚴重的氧化應激反應進而損傷腎組織[13]，其致病機制主要與細菌內毒素有關。在內毒素結合蛋白的幫助下，脂多糖可與單核細胞表面受體CD14、TLR4分子結合，形成三分子復合物，進而活化核內NF-κB與ERK等信號通路，釋放一些促炎性細胞因子，TNF-α是內毒素損傷效應中的關鍵介質[14]。本研究發現，CLP組腎組織NF-κB、TNF-α蛋白表達均高于S組，提示膿毒癥激活了腎組織的炎癥反應相關蛋白；G組、D組腎組織NF-κB、TNF-α蛋白表達均低于CLP組，提示桂枝去桂加茯苓白術湯能有效降低SAKI大鼠腎組織的NF-κB與TNF-α蛋白質表達，表明該方劑可能通過下調NF-κB與TNF-α信號通路活性，減少炎癥因子產生，從而抑制炎癥因子對腎組織的損傷；G組腎組織NF-κB、TNF-α蛋白表達均低于D組，提示桂枝去桂加茯苓白術湯對NF-κB、TNF-α蛋白的作用效果與藥物劑量有關。

綜上所述，桂枝去桂加茯苓白術湯可改善膿毒癥對腎組織的損傷，其機制可能與抑制NF-κB與TNF-α信號通路，從而減輕炎癥反應有關。