膀胱癌細胞及組織中長鏈非編碼RNA UCA1、miR-195表達變化及其與患者預后的關系

程琳，孫榮凱，付茂輝，向桂玲

(1山東省立第三醫院，濟南250031；2解放軍第960醫院；3復旦大學附屬金山醫院)

膀胱癌是泌尿系統常見的惡性腫瘤，是全球發病頻率最高的惡性腫瘤之一，侵襲性膀胱癌患者5年生存率低于60%[1]。長鏈非編碼RNA(LncRNAs)是內源性非編碼的調節性RNA分子，在不同生物進程中具有調節作用，如染色體失活、基因組印記與發育等[2]。近年研究發現，LncRNAs在包括膀胱癌在內的多種惡性腫瘤中表達異常[3]。尿路上皮癌抗原1(UCA1)是第一個在膀胱癌中檢測到的致瘤性LncRNAs，位于19p13.12基因位點[4]。UCA1在多種腫瘤中高度表達，如乳腺癌、胰腺癌、胃癌和結直腸癌，UCA1高表達可能作為預測這些腫瘤轉移和預后的分子標記物[5]。研究發現，LncRNAs與微小RNA(miRNA)可通過相互調控，影響腫瘤的發生、發展，其中miR-195可抑制胃癌、肺癌的生長和轉移，生物信息學軟件預測，miR-195可作用于UCA1基因[6]。但二者在膀胱癌中的表達相關性及與臨床病理特征的關系尚無報道。2013年6月～2015年1月，我們觀察了膀胱癌細胞及組織中UCA1和miR-195的表達變化，探討UCA1和miR-195表達與膀胱癌患者預后的關系。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器 人膀胱上皮永生化細胞株SV-HUC-1購自美國菌種保藏中心(ATCC)，膀胱癌T24細胞株購自中科院上海細胞庫。RPMI1640培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)；Star Spin Small RNA Kit(美國ABI公司)；LnRcute LncRNAs cDNA(美國ABI公司)；miRNA逆轉錄試劑盒(美國ABI公司)；實時熒光定量PCR試劑盒(日本Takara公司)；Nanodrop2000(美國Thermo Scientific公司)；熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)；高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

1.2 細胞培養及細胞分組 SV-HUC-1、T24細胞均培養于含10%胎牛血清的RPMI1640培養基，在5%CO2、37 ℃的培養箱中培養，以SV-HUC-1作為對照組，以T24細胞為膀胱癌細胞組。當細胞生長至對數生長期時，TRIzol法提取細胞的總RNA用于后續實驗。

1.3 膀胱癌組織標本及患者資料收集 選擇山東省立第三醫院2013年6月～2015年1月行根治性膀胱切除術的膀胱癌患者的組織標本50例，其中男42例、女8例，年齡38～74(58.35±7.31)歲。所有患者臨床資料完整，術前均未接受放療、化療及免疫治療，術后病理診斷均為膀胱尿路上皮癌。另選取患者離癌組織5 cm以上、外觀無異樣的癌旁組織作為正常對照，病理診斷均為正常膀胱組織。術中取材后，立即置于液氮罐中速凍，隨后在-80 ℃保存。選取的組織標本按WHO標準進行病理分級，其中G1級15例、G2級23例、G3級12例；按國際抗癌聯盟(UICC)標準進行臨床分期，其中T1期21例、T2期12例、T3期13例、T4期4例；按是否出現腫瘤浸潤，其中非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)15例、肌層浸潤性膀胱癌(MIBC)35例；腫瘤初發10例，復發40例。采集標本均經患者知情同意及醫院倫理委員會批準。

1.4 UCA1、miR-195檢測 采用RT-PCR法。參照試劑盒說明書，分別采用TRIzol法和Star Spin Small RNA Kit提取總RNA和總小RNA。選用LnRcute LncRNAs cDNA試劑盒將提取的RNA逆轉錄為cDNA；miRNA First Strand cDNA逆轉錄試劑盒將提取的small RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBR Green法檢測UCA1(GAPDH為內參)和miR-195(U6為內參)表達水平。UCA1、miR-195及內參引物由上海生物工程股份有限公司合成。UCA1上游引物5′-CTCTCCATTGGGTTCACCATTC-3′，下游引物5′-GCGGCAGGTCTTAAGAGATGAG-3′；miR-195上游引物5′-CTCAAGGCAACCTACCGAAAAG-3′，下游引物5′-TATCGGACCCATCACGGAGTGG-3′；GAPDH上游引物5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3′，下游引物5′-CCTGGAAGATGGTGATGCG-3′；U6上游引物5′-GATTAGAACCGTCGGTAACGGAA-3′，下游引物5′-AGCGATCTCGTTGGCCTTTCTACC-3′。UCA1基因反應條件：94 ℃預變性2 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s，40個循環；72 ℃延伸10 min。miR-195反應條件：94 ℃預變性2 min，94 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s，40個循環。PCR產物特異性用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，基因表達差異采用2-ΔΔCT法進行分析。以UCA1或miR-141相對表達量 2-ΔΔCT≥1為陽性表達。

1.5 術后隨訪 術后對50例患者進行隨訪至2018年1月。采用電話、訪視等方式進行隨訪，第1年每3個月隨訪1次，隨后每6個月隨訪1次，隨訪內容包括患者的生存狀態，其中已死亡患者包括死亡原因和死亡日期。所有患者均成功獲得隨訪，其間死亡患者以截尾數據統計，存活者均隨訪3年。

2 結果

2.1 兩組細胞中UCA1、miR-195表達比較 膀胱癌細胞組UCA1表達高于對照組、miR-195表達低于對照組(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組細胞中UCA1、miR-195表達比較

2.2 癌旁組織及膀胱癌組織中UCA1、miR-195表達比較 膀胱癌組織中UCA1表達高于癌旁正常組織，miR-195表達低于癌旁正常組織(P均<0.05)。見表2。

表2 癌旁組織及膀胱癌組織中UCA1、miR-195表達比較

2.3 膀胱癌組織中UCA1、miR-195表達與患者臨床病理特征的關系 膀胱癌組織中，UCA1陽性38例，miR-195陽性7例。病理分級較高、臨床分期T3～T4者、腫瘤浸潤及復發者UCA1表達較高，病理分級低者、臨床分期T1～T2者、腫瘤未浸潤及初發者miR-195表達較高(P均<0.05)。UCA1、miR-195表達與患者年齡、性別無相關性(P均>0.05)。見表3。

表3 UCA1和miR-195在膀胱癌組織中的表達與臨床病理資料的關系(例)

2.4 膀胱癌組織中UCA1與miR-195 mRNA表達的相關性 Pearson相關性分析示，膀胱癌組織中UCA1與miR-195表達呈負相關(r=-0.673，P<0.05)。

2.5 膀胱癌患者生存情況及其影響因素的Cox回歸分析結果 隨訪3年，所有患者均成功獲得隨訪，50例患者中存活患者27例，死亡患者23例，平均生存率為54.00%。采用Kaplan-Meier法計算患者6個月、1年、3年生存率分別為64.41%、61.96%、54.16%。患者生存率與患者的性別、年齡、病理分級、腫瘤浸潤及發病特點之間無明顯相關性(P均>0.05)。臨床分期T1～T2患者生存率高于T3～T4期患者，UCA1陰性表達患者生存率高于陽性表達患者，miR-195陽性表達患者生存率高于陰性表達患者(P均<0.05)。Cox回歸模型示UCA1 陽性表達、miR-195陰性表達、臨床分期T3～T4及腫瘤轉移是影響膀胱癌患者預后的獨立危險因素(P均<0.05)。見表4。

表4 影響膀胱癌患者生存因素的Cox回歸分析

3 討論

膀胱癌是最常見的泌尿系統惡性腫瘤，其發病率和病死率一直居高不下。膀胱癌患者死亡的主要原因是腫瘤的復發和轉移。當前，膀胱癌的治療以手術治療為主，但膀胱癌的多中心起源特性，使其具有易耐藥、易侵襲、易復發等特點，故目前對膀胱癌的研究主要集中在尋找從源頭調控膀胱癌生物學特性的有效靶點[7]。膀胱癌的發生、發展受多因素影響，如DNA突變、蛋白質異常，RNA異常也影響著膀胱癌的進展。LncRNAs是一類非編碼RNA，廣泛存在于細胞內，隨著對腫瘤發病機制研究的深入，國內外學者意識到LncRNAs在多種腫瘤中發揮重要的調節作用。LncRNAs對腫瘤的調控作用主要是通過影響細胞表觀修飾、信號轉導通路及RNA編輯等方式[8]。越來越多的報道顯示LncRNAs表達失調與包括膀胱癌在內的多種癌癥的病理機制密切相關，故LncRNAs未來有望成為腫瘤臨床診斷和治療的分子靶標[9]。

UCA1是膀胱癌中具有特異性和敏感性的致瘤LncRNAs，包含3個外顯子和2個內含子，其高表達也與多種癌癥的侵襲有關。劉詠松等[10]研究表明，膀胱癌細胞系中UCA1表達水平高于非膀胱癌細胞系，且膀胱癌組織中UCA1表達水平亦高于正常癌旁組織。Liu等[11]研究表明，膀胱癌組織中UCA1表達水平顯著高于癌旁正常組織，呈特異性表達。Milowich等[12]報告顯示UCA1的表達率越高，腫瘤病理分級越高或患者預后越差，UCA1促進膀胱癌的侵襲和轉移。本研究結果顯示，UCA1在膀胱癌細胞系中的表達水平顯著高于其在非膀胱癌細胞系的表達，膀胱癌組織中UCA1表達高于癌旁正常組織，提示UCA1的陽性表達與膀胱癌密切相關。為進一步探究UCA1與膀胱癌的聯系，我們還對UCA1表達與膀胱癌患者的臨床參數進行相關性分析，結果顯示UCA1表達與病理分級、臨床分期、腫瘤浸潤及發病特點顯著相關，隨著腫瘤惡性程度增高而增高。進一步分析顯示UCA1陽性表達患者的生存率低于陰性表達患者的生存率，提示UCA1陽性表達與膀胱癌患者的預后不良顯著相關，推測UCA1可作為膀胱癌診斷及預測患者預后的分子標志物。

近年來，對miRNA在腫瘤中的調控機制研究的較為廣泛，其參與了腫瘤多種生理病理過程，特別是在腫瘤發生、發展中起著重要作用。miRNA依據靶基因的不同，從而發揮不同的作用，既可促進癌癥的進展也可抑制癌癥的進展[13]。大量研究表明，miR-195在腫瘤增殖、侵襲和轉移中發揮著關鍵的轉錄調節作用，且在多種癌癥中抑制腫瘤細胞生長、遷移和侵襲[14]。Zhang等[15]研究顯示，miR-195作為一個抑癌基因，可抑制非小細胞肺癌(NSCLC)細胞的生長和轉移，在非小細胞肺癌中表達下調。本研究結果顯示，miR-195在膀胱癌細胞系中的表達水平低于其在非膀胱癌細胞系的表達，膀胱癌組織中miR-195表達低于癌旁正常組織，提示miR-195的陰性表達與膀胱癌發生密切相關。為進一步探究miR-195與膀胱癌的聯系，我們也對miR-195表達與膀胱癌患者的臨床參數進行相關性分析，結果顯示miR-195表達與臨床分期、腫瘤浸潤及發病特點顯著相關，隨著腫瘤惡性程度增高而降低；進一步分析顯示miR-195陽性表達患者生存率顯著低于陰性表達患者的生存率，提示miR-195陰性表達與膀胱癌患者的預后不良顯著相關，推測miR-195可能調控腫瘤轉移和侵襲，可作為判斷膀胱癌患者預后的新指標。

LncRNAs可以發揮miRNA“海綿”作用，與內源性RNA競爭，影響miRNA的調控作用。此外，LncRNAs可作為miRNA的前體直接影響miRNA的生物學功能，兩者相互作用影響腫瘤的發生、發展[16]。Cai等[17]報道顯示，通過沉默LncRNAs-TUG1可靶向上調miR-144表達，提高膠質細胞瘤血-腫瘤屏障的滲透性，增強抗腫瘤藥物的利用率。本課題組前期研究通過生物信息學軟件預測，發現miR-195可作用于UCA1基因，推測UCA1基因能夠與miR-195靶點結合，調控miR-195的表達[6]。本研究結果顯示，膀胱癌組織中UCA1與miR-195表達呈負相關，提示高表達的UCA1基因可能通過抑制miR-195表達從而調控膀胱癌的進程，二者在判斷膀胱癌預后中發揮著更重要的作用，但具體作用機制有待更進一步的研究。

綜上所述，膀胱癌細胞及組織中UCA1表達增高、miR-195表達降低，UCA1表達增高、miR-195表達降低均與膀胱癌患者的預后不良顯著相關，UCA1、miR-195對預測惡性腫瘤的生長、侵襲及預后發揮著重要的作用，聯合檢測UCA1與miR-195表達有望成為預測膀胱癌患者預后的分子標記物，為膀胱癌靶向治療提供新的思路。