中國狂犬病口服疫苗的研究進展及其應用的緊迫性

俞永新，石磊泰

當前狂犬病仍然是一種嚴重危害人類的疾病，每年全球約60 000人患病死亡，大約每10 min就有1人死亡。大多數(shù)的病例發(fā)生在非洲(36.4%)和亞洲(59.6%)，99%以上的病例由犬咬傷引起，其中小于15歲兒童占40%。然而人和犬狂犬病在大多數(shù)發(fā)達國家和部分發(fā)展中國家全球約50個國家都已消除，其措施主要是對犬進行大面積疫苗免疫和嚴格的預防手段。隨后采用減毒活疫苗對野生動物進行誘餌口服免疫，切斷野生動物狂犬病傳播給犬而再度發(fā)生人間狂犬病的危險性，最后達到持久性消除狂犬病。如歐洲和北美的許多國家已持續(xù)多年無狂犬病發(fā)生，但是在發(fā)展中國家人口多，犬的數(shù)量大，特別是那些難于接近的無主犬、流浪犬，采用注射方法對犬進行大面積免疫(一般要求應達到70%以上)十分困難，而且滅活疫苗的持久性短，需每年加強免疫，同時還有可能發(fā)生犬對注射人員咬傷的危險性。因此在口服疫苗對野生動物免疫成功的基礎上，WHO和狂犬病專家提出并建議采用誘餌減毒活疫苗對犬進行口服免疫，用以提高犬的免疫覆蓋率，達到消除和控制狂犬病的目標[1]。

動物口服疫苗的大面積現(xiàn)場應用最早于1978年在瑞士應用減毒活疫苗實施并證明其可行性。以后逐步擴大到歐洲其他國家和北美等國家，取得了降低野生動物狂犬病的明顯效果，同時也極大地減少被動物致傷發(fā)生的家畜狂犬病和暴露后免疫人數(shù)，最終消除了這些國家的人間傳染病。早期應用于疫苗的減毒株主要有重組痘病毒V-RG株和一些不同減毒水平的減毒株如ERA株、SADBern株、SADB19株和SAD5/88株，雖然這些毒株毒力顯著減弱，但仍然對小鼠和其他野生動物保留殘余毒力，存在傳播感染的危害性[2-4]。以后通過科學家的努力，已經(jīng)篩選到多株毒力更低，如對小鼠腦內(nèi)、口服，肌內(nèi)接種和其他動物無致病性的減毒株，其中二株毒種SAG2和V-RG已經(jīng)WHO認可，推薦用于野生動物和犬的口服免疫。SAG2株不但對小鼠腦內(nèi)接種無致病性，在乳鼠腦內(nèi)連續(xù)傳5代或細胞傳10代后，對小鼠仍無腦內(nèi)毒力，減毒基因未發(fā)生變化，表明其弱毒無返祖，遺傳穩(wěn)定性高，對犬和多種野生動物不致病[5-6]。SAG2株疫苗自1993年應用至今已有20多年的經(jīng)驗，在歐洲發(fā)放過2千萬劑誘餌疫苗，未發(fā)現(xiàn)疫苗病毒引起其他動物和人感染狂犬病的不安全問題，在愛沙尼亞、法國、意大利、瑞士、芬蘭等國家大規(guī)模應用后僅幾年就使這些國家消除了狂犬病[7]。V-RG株除在少數(shù)歐洲國家應用外主要用于北美國家并使加拿大、美國消除了狂犬病。

WHO認識到犬口服免疫對消除狂犬病的重要意義，自1988年以來曾多次發(fā)表立場文件支持關于犬口服免疫(OVD)的研究和應用。曾召開過多次WHO專家委員會，討論并制定有關犬用口服疫苗的研究、質(zhì)量控制標準和最低要求以及現(xiàn)場應用指南[8-16]。

中國科學家在國外動物口服免疫成功的啟發(fā)下，早在上個世紀80年代就開始著手研究動物口服免疫用毒種并進行犬口服免疫和安全性、有效性現(xiàn)場觀察，有些減毒株雖未進行犬的現(xiàn)場免疫觀察，但毒株的弱毒特征、免疫原性和遺傳穩(wěn)定性已接近和相當于國外現(xiàn)用的口服疫苗毒種，是很有應用前景的動物口服疫苗的候選株，現(xiàn)對這些毒株的研究進展過程綜述如下。

1 CTN-1毒株[17-18]

CTN-1毒種來源于1955年分離自山東省濟南市的狂犬病病人腦組織的狂犬病街毒CTN-S1，CTN-S1株在小白鼠腦內(nèi)連續(xù)傳49代后對小鼠的腦內(nèi)致病力下降，發(fā)病潛伏期由11～14 d縮短并固定在3～6 d，同時皮下毒力顯著降低，由4.0 lgLD50下降至1.5 lgLD50，表現(xiàn)為狂犬病固定毒，命名為CTN-M株。CTN-M株又經(jīng)KMB17株人二倍體細胞連續(xù)傳47代而適應于該細胞培養(yǎng)，命名為CTN-1株。CTN-1株的毒力進一步降低，對家兔腦內(nèi)平均病期由1 d延長至4～5 d，但對小鼠的腦內(nèi)毒力仍高于5.0 lgLD50。CTN-1病毒具有良好的免疫性，肌內(nèi)免疫8只犬，1個月后的中和抗體100%陽轉，均值>1∶320。

1.1CTN-1鼠腦疫苗(CTN-M22)[19]將CTN-1毒種在小白鼠腦傳2代，命名為CTN-M22毒種，以CTN-M22毒種接種鼠腦，取鼠腦研磨成腦懸液加適宜的穩(wěn)定劑制成疫苗。

1.1.1CTN-M22疫苗的安全性[19-20]在實驗室對犬及其他動物進行安全性研究，以現(xiàn)場用量的10倍量口服接種3個月齡健康幼犬10只，免疫后1、2、3 d連續(xù)3次取唾液分離病毒均為陰性。觀察6個月，動物未見狂犬病任何征象，均健康存活。對初生1月齡以內(nèi)乳犬口服免疫7只，觀察6個月亦安全存活。此外，還以肌內(nèi)注射和隱神經(jīng)浸潤注射成年犬各10只，接種后于不同時間剖殺1只，共5次，取局部淋巴結、腦、腎和唾液腺標本，用乳鼠腦內(nèi)接種法分離病毒，結果均為陰性，其余動物觀察3個月，無任何狂犬病癥狀，另外口服接種黃毛鼠和貓各5只，肌肉注射黃毛鼠5只，觀察21 d均健存[20]。

在應用現(xiàn)場對吉林省農(nóng)安縣和伊通縣229只家犬和廣西玉林縣19 196只犬進行口服免疫觀察，結果均未發(fā)現(xiàn)家犬出現(xiàn)任何癥狀，這些犬一直在犬主家放養(yǎng)，服苗犬與其他犬、豬等日常活動接觸頻繁，結果未發(fā)現(xiàn)這些動物的狂犬病發(fā)生，另對現(xiàn)場的懷孕母犬3只，產(chǎn)仔前服苗，共產(chǎn)仔犬15只，觀察6個月，未發(fā)現(xiàn)母犬發(fā)病和對仔犬的垂直傳播感染。

以上結果表明CTN-M22疫苗雖然對小白鼠有致病性，但對家犬十分安全，而且無對外傳播病毒感染其他動物的危害性。

1.1.2CTN-M22疫苗對犬的免疫性 以5.65和7.00 lgLD50的病毒量，按每只犬4 mL量分別口服10只家犬，1個月后的抗體陽轉率分別為81%和80%～89%，6月時分別為33.3%和83%～86%，疫苗有良好的免疫性，但病毒滴度高者抗體陽轉率更高，免疫持久性更長。

1.1.3CTN-M22疫苗對家犬的保護效果 1985年和1986年在廣西玉林市的20個鄉(xiāng)中，對其中13個鄉(xiāng)進行犬群口服免疫，免疫率分別為87.9%(4 456/5 069只犬)和87.3%(14 740/16 882只犬)，余下約12%未免疫犬作為內(nèi)對照，結果第一年內(nèi)免疫鄉(xiāng)無犬狂犬病發(fā)生，內(nèi)對照和相鄰的外對照分別發(fā)生狂犬病11只和9只，第二年內(nèi)對照和外對照鄉(xiāng)分別出現(xiàn)狂犬15只和22只。

1.1.4家犬免疫后對降低人狂犬病的效果 1984年前全玉林市20個鄉(xiāng)共發(fā)生人狂犬病27例，犬免疫后1985-1987年，玉林市共發(fā)病22例，其中在免疫前被咬傷者10例，未免疫內(nèi)對照9例，外來犬咬傷者3例，沒有1例是免疫犬引起的人狂犬病，表明家犬口服免疫對保護人群發(fā)生狂犬病具有十分顯著的效果。

1.2CTN-1細胞疫苗(CTN-1Vero細胞疫苗)[21]將CTN-1毒種在Vero細胞傳15代，病毒滴度達7.0～8.0 lgLD50/mL，收獲病毒培養(yǎng)液加5%～10%小牛血清作為保護劑制成口服疫苗。

1.2.1疫苗對家犬的安全性 以8.0和6.5 lgLD50病毒液分別口服各10只犬(第一組)和6只犬(第二組)，另口服2只犬不含病毒的誘餌作為對照組，口服后每天觀察犬的健康狀況共28 d，并于5、10、20、60 d各殺3只(第一組2只，第二組1只)解剖觀察病理變化并取腦和唾液腺分離病毒。結果觀察期間全部犬均健全，未發(fā)現(xiàn)異常體征，2只健康未接種疫苗的對照犬，未發(fā)現(xiàn)由疫苗病毒傳播的感染。腦和唾液腺經(jīng)BHK21細胞和乳鼠腦傳2代，均未分離到病毒。結果表明CTN-1疫苗對犬的口服接種是安全的，病毒并沒有在口腔內(nèi)復制并造成傳播感染。

1.2.2疫苗對家犬的免疫性 以8.1 lgLD50免疫的8只犬，抗體全部達到0.5 IU/mL以上，陽轉率100%，平均滴度2.59 IU/mL。以7.43 lgLD50免疫的4只犬，抗體陽轉率為50%，GMT為2.48 IU/mL。對照犬抗體陰性，結果表明CTN～1株對犬有良好的口服免疫效果。

2 CTN-181疫苗[22-24]

CTN-181減毒株來自CTN-1株經(jīng)KMB17人二倍體細胞傳80代又經(jīng)空斑克隆3次而獲得，其毒力較CTN-1株極大降低，對4周齡小鼠、家兔、豚鼠腦內(nèi)接種均不致病，乳狗肌內(nèi)注射未死亡(0/16),近神經(jīng)注射亦未死亡(0/5)，但對3周齡小鼠腦內(nèi)仍有輕度致病力。崔君兆等[25]以CTN-181株在BHK21細胞培養(yǎng)制備的活疫苗，在廣西靈川縣對出生14 d以上的健康家犬肌內(nèi)接種免疫。1980年共完成注射22 299頭犬，免疫率93.52%。選擇相鄰的臨桂縣作為對照縣，該縣共有14 d以上家犬30 575頭。免疫后觀察1年，結果接種疫苗的犬全部安全未發(fā)生狂犬病癥狀，犬大規(guī)模免疫后對犬和人的狂犬病均有明顯保護效果。

當年靈川縣共發(fā)生人狂犬病9例，發(fā)病率3.73/10萬。而免疫前1年(1979年7月至1980年6月)共發(fā)生25例，發(fā)病率8.69/10萬，保護率64.0%，免疫前后對比有顯著性差異(P<0.01)。未經(jīng)免疫的臨桂縣同期共發(fā)生人狂犬病25例，發(fā)病率7.18/10萬。二縣對比，保護率為51.4%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對靈川縣發(fā)生9例病人的分析，除1例由免疫犬咬傷外，其余7例均由未免疫犬或貓咬傷。據(jù)分析，雖然當時大規(guī)模免疫的免疫率高達93.5%，但以后不斷進入當?shù)氐奈疵庖呷當?shù)量很多，易感家犬積累多，據(jù)調(diào)查免疫后的免疫犬減少到37.5%。因此有必要對新生或引進的家犬隨時進行免疫才能更有效控制狂犬病的發(fā)生。另外疫苗免疫后對犬的保護，靈川縣免疫前1年共發(fā)生犬狂犬病28例，發(fā)病率1.17%，免疫后發(fā)生12例，發(fā)病率0.5%，免疫前后對犬的保護率為65.4%。

3 CTN181-3株疫苗[26-27]

CTN181-3株毒種為CTN-181減毒株通過豚鼠頜下腺連續(xù)傳3代后，經(jīng)空斑克隆純化1次，從19個毒力不同的病毒克隆株中篩選到1株對3周齡小鼠腦內(nèi)不致病，免疫原性良好、遺傳穩(wěn)定性高的病毒株，命名為CTN181-3。以CTN181-3株在BHK21細胞培養(yǎng)，病毒滴度達到≥6.0 lgPFU/mL時制備活疫苗。

3.1CTN181-3株的毒力 CTN181-3株以高滴度病毒(>6.50 lgPFU/mL)腦內(nèi)接種3周齡小鼠不致病，對2周齡小鼠的毒力亦顯著下降(死亡40%～55%)，肌內(nèi)或口腔感染3周齡小鼠亦均無致病性。較其母株CTN-181株對3周齡小鼠腦內(nèi)致病的毒力更低。

3.2CTN181-3株的免疫性、抗體應答和保護效果 以5.6 lgPFU/mL病毒肌內(nèi)或口腔免疫3周齡小鼠或地鼠1次，14 d后兩種動物兩種途徑免疫的中和抗體陽轉率均達到100%(GMT>1.34～12 IU/mL)。

3.3CTN181-3株的遺傳穩(wěn)定性 CTN181-3株的表型特性和分子特性均十分穩(wěn)定: 1) 病毒通過乳鼠腦內(nèi)傳5代，病毒滴度在7.10 lgPFU/mL，腦內(nèi)接種3周齡小鼠均不致病；2) 通過豚鼠頜下腺傳4代，病毒滴度在6.48 lgPFU/mL，對小鼠腦內(nèi)無致病性；3) 分別通過BSR細胞和vero細胞各傳10代，病毒滴度在6.4和6.7 lgPFU/mL，對小鼠腦內(nèi)或肌內(nèi)接種均無致病性；4) 兩種細胞各傳10代后的病毒減毒基因均未發(fā)生回復突變。

以上結果表明CTN181-3株的毒力對3周齡小鼠腦內(nèi)無致病性，對小鼠和地鼠口腔接種均無致病性，較其母株CTN-181株毒力進一步降低。特別是口腔免疫小鼠和地鼠1針，中和抗體100%陽轉，GMT高達5～10 IU/mL，對小鼠攻擊后的保護效果達100%，對地鼠為67%(免疫劑量太低，與小鼠相同均為0.1 mL)達到WHO對動物口服疫苗的實驗室毒力要求。有待進一步對犬等大動物的安全性免疫性評價和田間實驗。CTN181-3的親本株CTN-1株已經(jīng)對犬進行過口服免疫表明是安全的，CTN-181株已經(jīng)在現(xiàn)場肌內(nèi)接種家犬數(shù)萬頭證明是安全的，而CTN181-3株的毒力較其親本株更低，因此其對犬的安全性應更可靠。因此，CTN181-3株疫苗是一種很有應用前景的動物口服候選疫苗。

4 SRV9株疫苗[28-29]

SRV9株毒種是用國外引進的SAD狂犬病毒減毒株經(jīng)細胞3次空斑克隆，從數(shù)株克隆病毒中篩選得到。SRV9株的毒力較其親本株SAD更弱，對18 g和12～14 g小白鼠的口服、皮下、腦內(nèi)接種均不發(fā)病死亡，而親本株仍有個別發(fā)病。SRV9株對乳鼠的腦內(nèi)毒力亦明顯降低，14～17 d齡乳鼠腦內(nèi)感染病毒僅部分致死，18 d齡以上動物則不致死。SRV9對非靶動物如大鼠、豚鼠、梅花鹿、恒河猴肌內(nèi)注射均安全。SRV9株對農(nóng)村散養(yǎng)犬肌內(nèi)接種900余只，經(jīng)1年觀察均未見異常。

SRV9株具有良好的免疫原性，對12～14 g斷乳小鼠經(jīng)口服、皮下、腦內(nèi)接種免疫，1個月后的抗體陽轉率除口服組1只外(1/5)其他組均陽轉。同時，用狂犬病野毒肌內(nèi)攻擊，結果除皮下免疫組為80%外，其他組均為100%，而同時免疫的親本株SAD的保護率僅為30%～70%。另外，以海綿誘餌疫苗口服免疫犬1 000只，抽檢血清26份，陽轉率為23/26(88.5%)。

SRV9株全長基因序列的測序結果表明，與親本株SADB19相比，其158、575、971位堿基分別出現(xiàn)G→A，A→G和A→G的替換，導致第53、192、311位氨基酸出現(xiàn)Gly→Glu，His→Arg，Thr→Ala突變，該氨基酸的變化導致SRV9株毒力較其親本株更低，免疫力更強。因此SRV9株的減毒具有明確的分子基礎，可應用于疫苗質(zhì)量和毒株毒力穩(wěn)定性的監(jiān)控[30]。

以上結果表明SRV9具有良好的安全性和免疫性，以常規(guī)免疫劑量5～10倍的病毒量肌內(nèi)接種靶動物犬及非靶動物大鼠、豚鼠、梅花鹿及恒河猴均健康存活，無不良反應。經(jīng)1 500多只犬口服免疫，未發(fā)現(xiàn)對公共安全有任何不良影響，免疫性良好，1次口服免疫動物80%～100%動物獲得保護，毒力減弱具有明確的分子基礎。因此SRV9株是一株很有開發(fā)前景的動物口服用疫苗的候選毒種。

5 ERAmg333疫苗

北京中聯(lián)康生物科技股份有限公司對ERAmg333的安全性和免疫保護性做了系統(tǒng)的實驗認證，并對制備的疫苗做了全面的檢定，現(xiàn)將結果歸納如下：

5.1疫苗對動物的致病性 1) 疫苗對10～21 d齡小鼠腦內(nèi)、口服、肌內(nèi)注射均未發(fā)病；2) 對4周齡犬以高劑量(9.3 lgTCID50)口服或肌內(nèi)接種，未觀察到任何臨床癥狀；3) 對5周齡裸鼠和CB-17SCID小鼠口服或腦內(nèi)、肌內(nèi)接種，二種免疫缺陷型小鼠均無致病性；4) 對雞、兔子、豬等狂犬病非靶動物經(jīng)口服和肌內(nèi)注射均未觀察到任何臨床癥狀；5) 對靈長類動物的安全性，恒河猴超劑量口服后，觀察90 d，無任何臨床癥狀，唾液及糞便中均未分離到狂犬病病毒，解剖猴腦組織也未分離到狂犬病毒，HE染色未發(fā)現(xiàn)異常病理變化；6) 犬口服接種24 h后未發(fā)病，唾液及糞便等均無狂犬病病毒可檢出。

5.2弱毒毒力的遺傳穩(wěn)定性 病毒經(jīng)Vero細胞連續(xù)傳23代，后又在3 d齡乳鼠腦內(nèi)傳5代，結果各代病毒對3周齡小鼠均無致病性，糖蛋白基因序列未發(fā)生改變，表明該毒株的毒力和遺傳穩(wěn)定性十分穩(wěn)定，無毒力返強現(xiàn)象。

5.3免疫原性 口服免疫動物后以強毒株攻擊的保護率為100%，結果與進口疫苗的肌內(nèi)注射免疫對比，效果相同。但口服免疫途徑較肌內(nèi)注射簡便可行而且安全。另外恒河猴口服接種后2周，中和抗體陽轉率為80%，4周后達高峰。

以上結果顯示ERAmg333毒種的毒力低，對多種動物不同途徑感染均無致病性，遺傳穩(wěn)定性高，病毒經(jīng)不同方法傳代后毒力和基因未發(fā)生變化，適用于犬的口服途徑免疫，是1株很有應用前景的犬用口服候選疫苗，制備的疫苗已經(jīng)安全性、免疫性全面檢定合格，該項目已于2016年3月順利通過北京市科委的產(chǎn)業(yè)化項目驗收。

6 基因重組狂犬病病毒株

武漢生物制品研究所朱家鴻團隊以痘苗病毒天壇株為親本株，將狂犬病毒的糖蛋白G基因插入天壇株的TK區(qū)，構建表達狂犬病糖蛋白的重組痘苗病毒。該病毒肌內(nèi)免疫小鼠或狗二針后均可產(chǎn)生高滴度中和抗體(1∶200～1∶800)。2周后免疫小鼠用CVS固定毒和SW1街毒分別進行腦內(nèi)和肌內(nèi)攻擊，結果兩種病毒不同途徑攻擊保護率均達90%～100%[31-32]。以后又將狂犬病毒N和G基因同時插入構建成功同時表達N和G蛋白的雙表達重組病毒，其中NGc-1雙表達重組株對新生乳鼠的肌內(nèi)毒力、成熟的腦內(nèi)毒力和家兔皮膚毒力較其他重組株降低最大，對犬的免疫后產(chǎn)生高滴度中和抗體(1∶620)，以狂犬病街毒株SW1肌內(nèi)攻擊的保護率為100%[33]。

周明等[34]的一項研究將細菌的鞭毛蛋白基因克隆至狂犬病病毒的基因組中, 并拯救出重組病毒rLBNSE-Flic。為了比較rLBNSE-Flic和表達GM-CSF重組病毒(rLBNSE-GMCSF) 的免疫原性, 用這2 種重組病毒分別肌肉注射和口服免疫小鼠1針后, 同時以未插人任何基因的親本病毒(rLBNSE) 作為對照。肌肉注射免疫的小鼠, 在免疫后3周采血測中和性抗體, 并用50 LD50CVS-24攻毒。口服免疫的小鼠, 在免疫后3周強化免疫, 強化免疫后1周采血測中和抗體并攻毒。與親本病毒r LBNSE相比較, 無論是肌肉注射還是口服免疫, 重組病毒rLBNSE-GMCSF和rLBNSE-Flic都能產(chǎn)生較高滴度的中和抗體水平(24IU/ml)并具有較高的保護率。無論是肌肉注射還是口服免疫, 與親本病毒rLBNSE相比較, 重組病毒rLBNSE-GMCSF 和rLBNSE-Flic是更有效的疫苗, 并通過實驗證明其原因可能是由于招募和激活了更多的樹突狀細胞和B細胞，刺激產(chǎn)生更高水平的免疫應答。

郭霄峰等[35]的一項專利提到了一種狂犬病病毒重組毒株的制備，他們以狂犬病病毒株rHEP-Flury為骨架,分別將狂犬病毒G蛋白膜外抗原區(qū)基因片段及大腸桿菌熱敏腸毒素B亞單位基因插入rHEP-Flury的G基因和L基因之間的假基因區(qū)；拯救篩選獲得重組狂犬病病毒株rHEP-Get-LTB。該狂犬病病毒重組毒株rHEP-Get-LTB具有良好的復制能力以及安全性,通過Get和LTB基因的插入增強了疫苗株的免疫原性和黏膜免疫反應水平,口服免疫后可誘導較高水平的中和抗體,顯著優(yōu)于親本株rHEP-Flury,可以作為動物狂犬病口服疫苗的候選株。

7 中國應用動物口服疫苗的緊迫性

世界衛(wèi)生組織(WHO)、聯(lián)合國糧農(nóng)組織、世界動物衛(wèi)生組織(OIE)以及全球狂犬病防控聯(lián)盟等在2015年共同發(fā)起全球于2030年消除人間狂犬病[36]。其依據(jù)是全球已有50多個國家已經(jīng)消除了狂犬病，他們的根本措施是加強犬的管理和對犬實施大面積免疫達到免疫率70%以上的措施。特別是一些國家以口服免疫方式對野生動物全面大規(guī)模免疫，切斷野生動物狂犬病病毒傳播感染犬而再度引起人間狂犬病的流行，達到最終消除狂犬病。其次是用于野生動物口服疫苗也充分證實對犬和其他靶動物十分安全有效。因此，有關國家只要采用WHO推薦的現(xiàn)有動物口服疫苗毒株或符合WHO制定質(zhì)量標準和最低要求的毒株，結合注射用疫苗對犬實施口服免疫，提高犬的免疫覆蓋率達到70%以上就可以消除本國的人間狂犬病[36]。因此WHO十分重視發(fā)展動物用口服疫苗，特別是安全性和免疫性的質(zhì)量提高。目前已有多種減毒株可應用于動物口服免疫[1]。另外，隨著科學技術進步，美國等發(fā)達國家還應用反向遺傳學技術，對狂犬病病毒的基因組進行修飾改造而獲得多株高度減毒株，如采用突變毒力相關位點、雙聯(lián)或三聯(lián)突變G基因、插入增強免疫力的外源基因、基因缺陷減毒株等[37]。其中一株三聯(lián)G基因株SPBAANGAS-GAS-GAS株對乳鼠腦內(nèi)注射不致死，傳代后毒力穩(wěn)定未返祖，而且免疫性十分良好。小鼠經(jīng)街毒感染后16、24、48、72h 肌內(nèi)注射1劑該減毒株病毒，保護率分別達到90%、55%、40%、30%[38]。專家認為該減毒株的高度減毒和高免疫性有望用于人的暴露后治療免疫，是狂犬病疫苗研究中的重大突破[39-40]。當然，這種高度減毒株對動物的口服免疫也是很有應用前景的。

基于這一提高犬免疫覆蓋率的消除狂犬病的有效措施，一些國家如突尼斯、土耳其、斯里蘭卡、菲律賓、南非共和國、摩洛哥等已經(jīng)開始行動，對犬進行現(xiàn)場口服免疫的觀察，其結果均顯示疫苗都是安全的并具有提高犬的免疫覆蓋率的優(yōu)勢，并可節(jié)省大量人力和時間而且對疫苗注射人員更安全。其中斯里蘭卡以注射法免疫犬的最高覆蓋率只有60%而口服免疫可提高到71%；在土耳其59%散在犬無法注射免疫但可以通過口服免疫；菲律賓的觀察結果口服免疫對犬的免疫覆蓋率可達76%，1個月后抗體陽轉率可達71%[41-46]。

然而，中國的狂犬病防控措施多年來一直是加強對暴露后人群免疫，包括大量生產(chǎn)疫苗，提高疫苗質(zhì)量，增強群眾對暴露后免疫的意識，以及正確處理暴露后免疫措施等。這些措施對中國的狂犬病例下降也起到重要作用，人狂犬病例從以往的千例以上降到每年500多例，這一成果應歸功于衛(wèi)生部門的疫苗生產(chǎn)、質(zhì)量控制和各級疾病控制中心的共同努力，但沒有根本改變中國狂犬病的現(xiàn)狀。而且疫苗的使用量并沒有減少，2018年的人用狂犬病疫苗的簽發(fā)量仍高達1 500萬人份，病例雖有所下降但人被犬致傷的數(shù)量并沒有下降，根本原因是大量疫苗用于人而沒有用于犬。也說明農(nóng)業(yè)部對犬缺乏有效的監(jiān)管和免疫措施。中國狂犬病疫苗的產(chǎn)量(人份數(shù))已超過全球80%的份額，疫苗和免疫相關費用高達近100億元，付出的代價是世界第一，但狂犬病的病例數(shù)量是世界第二，死亡人數(shù)高居各類法定報告?zhèn)魅静∏傲校瑑H次于艾滋病和結核病。因此不采取國際上控制消滅狂犬病的有效措施，即對犬加強管理和免疫率達70%以上以及野生動物的口服免疫的措施，僅依靠對人的暴露后免疫，狂犬病的下降速度是很慢的，很難達到完全消滅。中國人口規(guī)模大而養(yǎng)犬數(shù)量多，據(jù)不完全統(tǒng)計約為1億頭而犬的免疫率不到20%，而農(nóng)村的狂犬病發(fā)生率最多，但犬的免疫率卻最低，據(jù)新華網(wǎng)報道：新華每日電訊記者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在城市辦理養(yǎng)犬證和動物疫苗接種等規(guī)定流于形式，疫苗接種并沒有完全到位；在農(nóng)村，犬的疫苗接種率極低，記者走訪的幾個村莊散養(yǎng)犬不少，但養(yǎng)狗者都沒有聽說過要給狗打疫苗。我國狂犬病病例絕大多數(shù)發(fā)生在農(nóng)村，但各方數(shù)據(jù)顯示，農(nóng)村散養(yǎng)犬的疫苗接種率可能只有一到兩成[47]。

犬免疫率低的原因主要是主管犬的農(nóng)業(yè)部門對犬的管理和免疫缺乏有效措施，實際上國際上普遍認為僅以注射方式給大量散養(yǎng)犬、無主犬注射存在許多困難，達到70%免疫率難度很大。因此科學家發(fā)明的以口服方式給犬和野生動物免疫是“一項創(chuàng)新性突破”。

其實，中國老一代知名科學家如獸醫(yī)界殷震院士、侯世寬、高云教授，人醫(yī)界崔君兆、褚菊仁、嚴子林教授等，在國外動物口服疫苗的成功經(jīng)驗啟發(fā)下，早在20世紀80年代就已著手研究動物用口服疫苗減毒株，并進行了實驗室和現(xiàn)場的犬口服疫苗評價實驗。

但是早期篩選和應用的毒株對小鼠的腦內(nèi)毒力仍然較高，存在潛在危險性，中國科學家們又進行了對病毒株的繼續(xù)減毒純化篩選，結果目前獲得幾株毒株都是毒力很低，不但對小鼠腦內(nèi)接種或口腔接種無致病性，而且通過乳鼠腦內(nèi)傳5代或細胞傳10代，各代病毒對小鼠腦內(nèi)仍無致病性，而且減毒的基因全部沒有發(fā)生回復突變，表明其不但毒力高度減弱，遺傳穩(wěn)定性也十分穩(wěn)定，不可能產(chǎn)生傳播感染。其表型和基因型特性與WHO認可并在國際上廣泛應用于口服免疫達20多年，證明安全有效的SAG2株減毒活疫苗相似或接近[5]。特別是CTN181-3株，其原始母株(CTN-1株)是較近時期(1955年)分離自國內(nèi)的狂犬病野毒株，其全基因序列較其他國內(nèi)外疫苗株病毒更接近于國內(nèi)當前狂犬病流行株病毒[48]。CTN181-3株的全序列測序和對比也表明更接近與國內(nèi)分離株，因此更適用于預防中國的狂犬病流行株的感染。

因此，以上這些毒株都是很有應用前景的候選疫苗毒株，2030年全球消除人間狂犬病，這個任務十分艱巨，不著手對犬的加強管理和免疫接種是難于完成任務的。以往中國犬用疫苗為減毒活疫苗，其減毒株毒種為Flury LEP和ERA株，殘余毒力仍然較強，對小鼠有致病性[2,18]，特別是Flury LEP株對幼鼠肌內(nèi)感染有致病性，腦內(nèi)毒力高達4.0lgLD50[22],因此有可能發(fā)生免疫犬的病毒傳播到自然界感染動物和人[49]。禁止應用這類活疫苗是正確的，但是現(xiàn)在WHO認可和國際上通用的減毒株要求毒力高度減弱，不但對小鼠腦內(nèi)注射不發(fā)病，在乳鼠腦內(nèi)和細胞培養(yǎng)傳代多次后，弱毒保持穩(wěn)定沒有回升，遺傳穩(wěn)定性十分穩(wěn)定。國外大量應用也沒有發(fā)現(xiàn)疫苗株弱毒返祖?zhèn)鞑ネ饨绛h(huán)境的現(xiàn)象，因此對這類減毒株不應籠統(tǒng)禁止應用。滅活疫苗的免疫持久性短，需多次注射，且給大量散養(yǎng)犬、無主犬注射難度大，還經(jīng)常發(fā)生被注射犬傷人的不安全現(xiàn)象，因此對養(yǎng)犬數(shù)量大的國家以注射方式達到70%以上的免疫率是十分困難的。當前唯一可行提高免疫率的措施應該是在注射滅活疫苗的免疫基礎上結合減毒活疫苗的口服免疫。

特別是中國的實際情況是犬的數(shù)量大，注射免疫達70%覆蓋率的難度大，口服免疫是唯一可行的提高免疫率的措施，另外在人間狂犬病得到基本控制后，為避免野生動物狂犬病的傳入而再度發(fā)生人間狂犬病，也必須對野生動物及時實施大規(guī)模的口服免疫措施，切斷野生動物狂犬病傳染源，才有可能達到持久穩(wěn)定的消除中國人間狂犬病，因此中國消除狂犬病，對犬和野生動物的口服免疫是一項必不可少的重大措施。國家應有緊迫感，抓緊研制犬口服疫苗和應用。其實犬口服疫苗的應用對中國控制和消滅狂犬病的重大作用，我國著名獸醫(yī)學專家殷震院士早在上世紀80年代就提出“狂犬病口服免疫，簡便、易行，一旦推廣，不僅可大大提高對犬的免疫覆蓋率，還可為野生動物狂犬病預防提供良好前景[28]”, “我們相信口服免疫的方式可能成為消滅狂犬病的最佳途徑[50]。”

最近世界狂犬病知名專家，WHO狂犬病官員Cliquet F、Meslin和Rupprech 教授署名發(fā)表文章指出[51]“犬的口服免疫是一項經(jīng)充分研究過的，但作為消滅人間狂犬病的工具仍被低估”，并強調(diào)“發(fā)展中國家應更明智地應用犬口服免疫(OVD)幫助完成2030年全球人狂犬病為0的目標”。新華網(wǎng)總結國內(nèi)才學鵬、俞永新、涂長春等權威狂犬病研究專家認為，首先要關口前移，強化獸醫(yī)部門在狂犬病防控中的核心作用，在全國實行犬的狂犬病強制免疫制度。加強狂犬病的科學研究、成果轉化和應用，大力鼓勵、支持有條件的單位和企業(yè)開展犬用狂犬病口服誘餌疫苗，使犬的接種率快速達到70%以上的國際公認水平，阻斷病毒在犬之間的傳播。

2018年最新一次的WHO專家委員會報告[1]已進一步將犬的口服免疫提上了議程，明確指出一些國家在犬的大規(guī)模注射免疫中無法達到70%免疫覆蓋率時應考慮把犬的口服免疫納入本國消除狂犬病的策略中。同時對犬口服疫苗的質(zhì)量標準做了具體規(guī)定，對國家批準犬口服疫苗用于現(xiàn)場的要求和辦法也做了建議，這些建議對我國當局及時和加速批準中國犬用口服疫苗的應用很有指導和參考意義。

7 結 語

狂犬病的控制和消滅，加強犬的管理和大面積免疫是消除我國狂犬病的核心策略和根本措施，而犬的口服免疫是提高犬免疫覆蓋率能夠達到70%以上最有效的手段。WHO已明確犬口服免疫疫苗對消除狂犬病的重要意義并已制定疫苗的質(zhì)量標準和批準應用的建議，中國已有犬口服疫苗的候選毒株和現(xiàn)場應用的經(jīng)驗，國家應充分支持這些毒株進一步完善，以及對犬和其他大動物的擴大實驗和田間現(xiàn)場觀察，盡快投入生產(chǎn)和實際應用。但完成這一階段困難還是很大的，應有農(nóng)業(yè)部的重視和大力支持，國家財政劃撥狂犬病防治專項經(jīng)費的投入。

利益沖突：無