牧草葉綠素衍生物植烷酸對(duì)動(dòng)物機(jī)體的影響

靳思玉，李苗苗，曹 陽

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶163319）

1 葉綠素含量在牧草不同階段的變化

1.1 葉綠素的種類 葉綠素有幾個(gè)不同的類型：葉綠素a和b是主要的類型，見于高等植物及綠藻；葉綠素c和d見于各種藻類；葉綠素c罕見見于某些金藻；細(xì)菌葉綠素見于某些細(xì)菌。在綠色植物中，葉綠素位于葉綠體內(nèi)的膜狀盤形單位類囊體（徐冉等，2016）。

1.2 牧草生長期 葉綠素的含量可以反映植物的光合作用能力、植物的生理狀態(tài)、營養(yǎng)水平、生長和發(fā)育階段。馮淑華等（2011）對(duì)不同處理玉米植株葉片葉綠素含量在全生育期曲線變化趨勢(shì)的研究中發(fā)現(xiàn)，葉綠素含量的最大值均出現(xiàn)在抽雄期，各處理其他苗期葉綠素含量相差不多，抽穗期后下降趨勢(shì)相似，下降速度與幅度各不相同，龍輻208下降較快，成熟期高油115葉綠素含量最高。生育前期中原單32葉綠素含量較其他兩個(gè)品種高，生育后期下降較快。

Shi等（2014）測(cè)量了模擬秋季氣候變暖對(duì)四種本地草本植物的影響，其分別代表青藏高原的高山草甸植物的不同生命形式。試驗(yàn)在開頂室（OTCs）中進(jìn)行模擬，對(duì)葉綠素、氮（N）濃度的下降、根內(nèi)的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物（TNC）、生長期和物候期的影響進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果表明，秋季氣候變暖延緩了植物衰老過程中葉綠素的降解，并在隨后的幾個(gè)階段加速了葉綠素的降解。氣候變暖也增加了根TNC的儲(chǔ)存，增加了碳水化合物的積累。Fiedler等（2014）檢測(cè)高粱葉片與干物質(zhì)生長速率及葉綠素含量與溫度的關(guān)系，測(cè)試環(huán)境控制溫度9.4～20.8℃，其結(jié)果表明，在低溫下葉綠素含量對(duì)干物質(zhì)生長速率沒有很大的影響。

1.3 牧草收獲期 水稻在乳熟期收獲，葉綠素含量最高，隨著收獲時(shí)間的推移葉綠素含量逐漸下降（陳維君，2006）。Hasperué等（2013）研究表明，西蘭花收獲的時(shí)間可以影響葉綠素的降解速率。這種蔬菜是在其發(fā)育不完全的情況下收獲的，從而引發(fā)了快速的衰老，伴隨著葉綠素的降解和貯藏壽命的縮短。8：00收獲比18：00收獲降解速率要慢，這說明新陳代謝的變化會(huì)影響白天的基因表達(dá)。

海鼠漿果在早期（9月）、成熟期（11月）和后成熟期（1月）收獲。George等（2007）分析了整個(gè)漿果的物理特性，并對(duì)其進(jìn)行了生物活性成分的分析，結(jié)果表明，11月收獲的漿果總類胡蘿卜素和葉綠素含量最高。不同種類的牧草作物在不同的收獲期葉綠素含量會(huì)有不同程度的波動(dòng)，所以要根據(jù)牧草的種類選擇適合的收獲時(shí)期。

1.4 牧草貯藏 葉綠素的生物合成需要通過一系列的酶促反應(yīng)，溫度過高和過低都會(huì)抑制酶反應(yīng)，甚至?xí)茐脑械娜~綠素，一般植物葉綠素生物合成的最適溫度為30℃（王平榮等，2009）。Nagata等（2005）對(duì)聯(lián)乙烯還原酶DVR酶在10～30℃時(shí)的活性進(jìn)行了研究，結(jié)果在30℃時(shí)該酶的活性最大。因此，適宜的貯藏溫度是保持牧草中葉綠素含量的必要條件。

1.5 牧草加工 在堿性條件下，葉綠素a和葉綠素b降解需要更長時(shí)間，提高pH可以延緩葉綠素的降解。因?yàn)槿~綠素在中性或偏堿性條件下可皂化水解為鮮綠色的葉綠酸鹽、葉綠醇和甲醇，其中葉綠酸鹽和甲醇均為較穩(wěn)定的綠色化合物，因此堿性條件下可以保持綠色（張麗華等，2012）。但是pH過大會(huì)嚴(yán)重破壞果漿中的維生素C含量和產(chǎn)生堿味，因此加工中微堿性（pH 7.5左右）是較佳的護(hù)綠條件（韓勇，2007）。

2 葉綠素衍生物的結(jié)構(gòu)

葉綠素的基本結(jié)構(gòu)是由4個(gè)吡咯環(huán)結(jié)合成的卟啉分子，其中間靠各吡咯環(huán)的一個(gè)氮原子協(xié)同結(jié)合一個(gè)鎂原子（血紅素結(jié)合一個(gè)鐵原子，稱亞鐵原卟啉）（侯紅英，2006）。葉綠素的衍生物有葉綠醇、植烷酸和降植烷酸。葉綠醇是植物葉綠素分子中的一種含有多支鏈的脂肪醇（Judy等，1990），由四個(gè)異戊二烯單位組成的鏈狀雙萜類物質(zhì)，是一個(gè)親脂的脂肪鏈，其決定了葉綠素的脂溶性（Luisetti等，1979）。葉綠醇可通過α-氧化產(chǎn)生降植烷酸，再通過β-氧化生成植烷酸。植烷酸是一種有分支的飽和脂肪酸（Nagai，2015），具有異戊二酸的結(jié)構(gòu)，是葉綠素分子鏈在反芻動(dòng)物瘤胃中經(jīng)微生物降解而形成的（Scho..nfeld等，2006）。

3 葉綠素衍生物分解代謝過程

葉綠醇在乙醇脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)?-植烷烯醛，2-植烷烯醛通過脂肪醛脫氫酶催化轉(zhuǎn)化為2-植烷烯酸，然后在脂肪酸脫氫酶作用下轉(zhuǎn)化為植烷酸（Verhoeven等，2001）。植烷酸由于甲基在3個(gè)碳原子的位置上不能通過β-氧化生成3-酮乙基-CoA（Wanders等，2011），因此首先需要在過氧化酶作用下進(jìn)行α-氧化，即2-植烷烯酸由酯酰CoA合成酶催化生成植烷烯酸CoA，隨后在植烷烯酸CoA還原酶作用下轉(zhuǎn)化為植烷酰CoA，后者在植烷酰CoA羥化酶的作用下進(jìn)一步生成2-羥基植烷酰CoA（Mukherji等，2002），再通過2-羥基植烷酰CoA裂合酶轉(zhuǎn)化成降植烷醛，降植烷醛最后在脂肪醛脫氫酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榻抵餐樗岫M(jìn)行β-氧化（Hashimoto等，2006）。

4 葉綠素衍生物中植烷酸對(duì)機(jī)體中營養(yǎng)物質(zhì)代謝的影響

植烷酸不僅是機(jī)體氧化代謝的重要能量來源，而且在糖脂代謝、脂肪細(xì)胞分化聚酯調(diào)控方面具有特殊的生物學(xué)功能（關(guān)錦毅等，2009）。人體不能將葉綠素轉(zhuǎn)化為植烷酸，只能通過乳制品、反芻動(dòng)物肉和一些海洋脂肪來攝取植烷酸（Brown等，1993）。

4.1 糖類代謝 在糖代謝中，葡萄糖居主要地位。Heim等（2013）研究表明，100μmol/L的植烷酸可使肝細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因表達(dá)水平提高2.2倍，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ⅱ和葡萄糖激酶的基因表達(dá)水平提高3倍，肝細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和氧化利用增加。Che等（2013）用豬肌管作為測(cè)量葡萄糖攝取和糖原合成的模型，并檢查植烷酸與胰島素結(jié)合的生理劑量對(duì)葡萄糖攝取和糖原合成的影響。結(jié)果表明，植烷酸與胰島素結(jié)合使用增加了大約35%的葡萄糖攝入，而胰島素的存在進(jìn)一步增加了攝入，但在高胰島素濃度下增加也不明顯。在植烷酸與胰島素結(jié)合作用下糖原合成增加了20%。表明植烷酸可以在高濃度或不充分的胰島素濃度下刺激葡萄糖的吸收，從而提高乳汁中乳糖的含量。

Heim等（2002）研究表明，植烷酸不僅可作為PPAR的一個(gè)轉(zhuǎn)激活受體被廣泛用于治療2型糖尿病，而且還可以通過PPARb和PPARg在CV-1細(xì)胞中發(fā)生作用，這些細(xì)胞與各自的受體和一個(gè)無氧基輔酶反應(yīng)的熒光素酶相結(jié)合。與其他脂肪酸不同的是，生理濃度的植烷酸可增加老鼠主要肝細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取。通過定量實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶鏈反應(yīng)，可以解釋葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1-2和葡萄糖激酶mRNA表達(dá)的增加。這些結(jié)果表明，植烷酸可通過不同的PPAR等形式來調(diào)節(jié)與葡萄糖代謝相關(guān)的基因表達(dá)，從而暗示植烷酸在胰島素抵抗管理中的潛在作用。Schluter等（2002）研究結(jié)果表明，口服植烷酸（5 mg/kg）顯著改善了葡萄糖穩(wěn)態(tài)，提高了血清脂聯(lián)素水平，具有抗糖尿病作用。可以治療和預(yù)防非胰島素依賴型糖尿病或其他葡萄糖耐受不良有關(guān)的疾病，比如肥胖（Villarroya等，2004）。

4.2 脂類代謝 研究表明，在攝入植烷酸后，可增加脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá)（Elmazar等，2013），林夏菁等（2012）在葉綠醇對(duì)小鼠生長性能和糖脂代謝影響的研究中發(fā)現(xiàn)，在小鼠日糧中添加0.5%葉綠醇可以顯著降低前兩周體重，但對(duì)全期體重?zé)o明顯影響。另外，還可增加肝臟指數(shù)和肌肉比例，降低脂肪比例，促進(jìn)小鼠的肌肉發(fā)育。膳食植烷酸能顯著地增加小鼠的肝脂肪酸氧化酶活性和mRNA的豐富程度（Hashimoto等，2006）。

在牛脂肪細(xì)胞中添加植烷酸和降植烷酸后發(fā)現(xiàn)，植烷酸可以顯著提高脂肪細(xì)胞PPAR的mRNA表達(dá)。其中100μmol/L的植烷酸比對(duì)照組提高了6倍，而100μmol/L降植烷酸比對(duì)照組提高了4.5倍（Takahashi等，2002）。結(jié)果表明，非酯化的植烷酸可改變線粒體內(nèi)膜的滲透性，增加H+的電導(dǎo)，促進(jìn)滲透孔的打開，啟動(dòng)內(nèi)源性Mg2+的釋放。但與非酯化的長鏈脂肪酸相反，植烷酸會(huì)輕微地刺激內(nèi)膜傳導(dǎo)K+和Cl-。這些活動(dòng)對(duì)線粒體腺苷5-三磷酸腺苷的合成和線粒體的完整性都是有害的（Chaudhary等，2017）。植烷酸具有特定的原生生物活性，可誘導(dǎo)活性氧（ROS）生成，并減少ATP的生成，明顯抑制Na+-K+-ATP酶活性（Sch..onfeld等，2016）。植烷酸的氧化是一種線粒體的過程，唯一需要的輔因子是ATP和Mg2+（Skjeldal等，1987）。

Schluter等（2002）研究表明，植烷酸能激活核激素受體，影響基因表達(dá)和細(xì)胞分化，誘導(dǎo)棕色脂肪細(xì)胞分化。棕色脂肪和棕色脂肪細(xì)胞是植烷酸酶基因高表達(dá)的場(chǎng)所，這種酶是一種對(duì)植烷酸進(jìn)行過氧化物氧化的酶。然而，植烷酸的作用并沒有被其α-氧化產(chǎn)物降植烷酸所介導(dǎo)，降植烷酸沒有促進(jìn)褐色脂肪細(xì)胞的分化，也沒有刺激非耦合蛋白-1基因的轉(zhuǎn)錄。此外，對(duì)小鼠的急性低溫暴露導(dǎo)致了褐色脂肪組織中植烷酸儲(chǔ)存的劇烈動(dòng)員，這表明，在棕色脂肪中含有大量的植烷酸，可能會(huì)導(dǎo)致組織在對(duì)熱原性激活的反應(yīng)中出現(xiàn)適應(yīng)性變化。

植烷酸增加了棕色脂肪細(xì)胞中蛋白質(zhì)-1（UCP1）的mRNA表達(dá)，誘導(dǎo)了UCP1基因啟動(dòng)子的表達(dá)，其通過與一種類視黃醇受體（RXR）表達(dá)載體的結(jié)合而得到增強(qiáng)（Schluter等，2002）。植烷酸對(duì)UCP1基因的影響需要5個(gè)基因的增強(qiáng)區(qū)，而植烷酸的作用是通過3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)對(duì)RXR進(jìn)行調(diào)節(jié)的。植烷酸能激活褐色脂肪細(xì)胞的熱原性功能，其構(gòu)成了一種潛在的營養(yǎng)信號(hào)，將飲食狀態(tài)與適應(yīng)性熱發(fā)聯(lián)系起來（Zomer等，2000）。

4.3 預(yù)防維生素A致畸性 非懷孕動(dòng)物的藥代學(xué)研究表明，葉綠醇與植烷酸降低了視黃醇和視黃醇的血漿水平，并顯著降低了致畸性視黃醇代謝物全反式維甲酸的水平（Arnhold等，2002）。植烷酸可以通過干擾視網(wǎng)膜色素上皮中的維生素A代謝，或通過改變光感受器細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)來引起視網(wǎng)膜變性（Bernstein等，1992）。葉綠醇和植烷酸對(duì)預(yù)防維生素A的致畸性有幫助。

5 葉綠素衍生物中植烷酸對(duì)機(jī)體的作用

5.1 免疫系統(tǒng) Nakanishi等（2016）研究小鼠的脾細(xì)胞受到T細(xì)胞絲分裂素的刺激時(shí)，加入植烷酸，然后對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的生成進(jìn)行評(píng)估發(fā)現(xiàn)，植烷酸能在不抑制T細(xì)胞增殖的情況下產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用，其有效濃度小于10μmol/L。其結(jié)果表明，植烷酸對(duì)治療T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病具有潛在的有益作用。植烷酸是一種具有高效力的過氧化物酶體，其與細(xì)胞炎癥、抗氧化和氧化應(yīng)激有關(guān)。

1999—2002年，在萊克內(nèi)斯進(jìn)行了336個(gè)病例和460個(gè)對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，植烷酸類食物或全植酸的攝入量，與增加的非霍奇金淋巴瘤（NHL）危險(xiǎn)有關(guān)。在NHL亞型的分層分析中，牛肉消耗的增加與擴(kuò)散的B細(xì)胞淋巴瘤的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，而更多的牛奶攝入則與濾泡性淋巴瘤（FL）的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。全植酸的攝入與患癌和淋巴細(xì)胞性白血病的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。全植酸和植烷酸類食品可能會(huì)增加NHL的風(fēng)險(xiǎn)（Wright等，2012）。

5.2 血液成分 人類血清中植烷酸水平與反芻動(dòng)物肉和乳制品的攝入量密切相關(guān)，而這些產(chǎn)品的植烷酸濃度與牛飼料中的葉綠素含量密切相關(guān)。在人體中，植烷酸的降解首先是對(duì)植烷酸的活化，然后是一個(gè)α-氧化循環(huán)（Ollberding等，2013）。

Ellinghaus等（1999）研究發(fā)現(xiàn)，植烷酸的血清濃度與編碼過氧化物酶和肝脂肪酸結(jié)合蛋白質(zhì)的基因表達(dá)有良好的關(guān)系，這些蛋白質(zhì)都被證明在其啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)具有功能活性。將小鼠肝細(xì)胞系MH1C1和植烷酸培養(yǎng)后，對(duì)酰基輔酶氧化酶基因表達(dá)的刺激作用也進(jìn)行了觀察發(fā)現(xiàn)，植烷酸誘導(dǎo)了一種具有強(qiáng)效性的增氧劑氯霉素轉(zhuǎn)移酶活性因子。植烷酸作為一種PPAR依賴性基因表達(dá)的誘導(dǎo)物，能與支鏈脂肪酸對(duì)重組PPARP高親和力結(jié)合。植烷酸可以被認(rèn)為是一種真正的生理配體。研究指出，該過程與過氧化物酶體增殖激活物受體（PPAR）和視黃醇受體（RXR）的激活密切相關(guān)，被認(rèn)為對(duì)代謝功能障礙有預(yù)防作用（Ellinghaus等，1999）。

Watkins等（2010）研究表明，人類和類人猿的飲食中含有大量的植烷酸時(shí)，血紅細(xì)胞的水平升高。當(dāng)飼喂奶牛的日糧中青綠飼料占比較大時(shí)，牛奶中含有的植烷酸含量會(huì)增加，從而導(dǎo)致消費(fèi)者血漿中植烷酸的循環(huán)水平更高（Nagai，2015）。從乳制品中攝入高脂肪的飲食與增加的血漿酸濃度有關(guān)，這可能在癌癥的發(fā)展中起著重要作用（Watkins等，2010）。

5.3 神經(jīng)系統(tǒng) Nagai等（1999）在體外酶試驗(yàn)及神經(jīng)細(xì)胞的試驗(yàn)中，對(duì)植烷酸對(duì)組蛋白脫乙酰酶（HDAC）活性的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，植烷酸在體外增強(qiáng)了酶的活性，在神經(jīng)2a細(xì)胞中，植烷酸大大降低了組蛋白乙酰化和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，但是會(huì)被丁酸鈉的HDAC抑制劑抑制。植烷酸是一種常見的HDAC活化劑，其對(duì)神經(jīng)2a細(xì)胞的生存能力有類似的影響，這種效應(yīng)也被丁酸鈉所抑制。植烷酸降低了細(xì)胞內(nèi)活性線粒體的水平，而丁酸鈉則提高了這一水平。這些結(jié)果表明，在神經(jīng)2a細(xì)胞中通過激活HDAC，植烷酸會(huì)誘發(fā)線粒體異常和細(xì)胞死亡。這種由植烷酸引起的HDAC活化作用可能會(huì)引起神經(jīng)損傷和其他的由植烷酸積累引起的紫斑病。

Borges等（2015）對(duì)植烷酸在小白鼠小腦內(nèi)的大量氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)參數(shù)進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)其進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，植烷酸顯著地增加了丙二醛（MDA）和一氧化氮的生產(chǎn)和降低了谷蛋白（GSH）水平，對(duì)2-7-二氯熒光素氧化（DCFH）、硫酰氧化、羰基含量以及谷硫酶（GPx）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷氨磷酸酶（GR）和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）沒有影響；此外，免疫組化學(xué)分析顯示，植烷酸在小腦中引起了星形膠質(zhì)和蛋白質(zhì)的損害；還觀察到，合成酶抑制劑亞硝基左旋精氨酸甲酯（L-NAME）阻止了MDA的增加，而沒有降低GSH的水平，植烷酸所引起的免疫組化學(xué)變化也沒有減少。證明植烷酸會(huì)破壞氧化還原反應(yīng)，并引起老鼠小腦的星形膠質(zhì)細(xì)胞分裂，氧化還原狀態(tài)的不平衡可能至少在一定程度上導(dǎo)致了受Refsum病和其他疾病影響的小腦改變。植烷酸還在小腦和大腦皮層中引發(fā)了蛋白質(zhì)氧化損傷，這是由增加的羰基含量和亞硫酸氫氧化所決定的。由多種線粒體功能失調(diào)、活性氧的生成以及通過在膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的濃縮Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)途徑來調(diào)節(jié)的（Borges等，2015）。此外，植烷酸明顯降低了GSH的濃度，而褪黑素的治療完全阻止了這種效果。

5.4 活性氧 植烷酸是由葉綠素在反芻動(dòng)物瘤胃和腸道內(nèi)的微生物降解而形成的。處于β位置的甲基可以通過β-氧化途徑阻止植烷酸降解（Leipnitz等，2010）。因此，植烷酸的降解是由氧化還原酶的氧化作用引起的。植烷酸在線粒體和完整的細(xì)胞中產(chǎn)生了大量的ROS（Xu等，2006）。Chaudhary等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，植烷酸顯著增加了細(xì)胞內(nèi)ROS和活性氮的水平，植烷酸不能直接引起細(xì)胞死亡，而是在線粒體內(nèi)在途徑的作用下，通過線粒體的分裂來誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。植烷酸在各種代謝紊亂中積累。在機(jī)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的高水平植烷酸超過毫米范圍時(shí)，由于一種常見的過氧化物酶體功能障礙，或者是由于酶的缺陷可以導(dǎo)致Refsum病（Chaudhary等，2016）。

降植烷酸和植烷酸是膜鏈脂肪酸，其在Refsum病、Zellweger綜合征和α-甲基環(huán)丙酸酶缺乏癥等疾病中扮演著重要的角色。研究表明，植烷酸的毒性作用是由多種線粒體功能失調(diào)引起的。植烷酸對(duì)腦細(xì)胞有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用，通過急劇的Ca2+解除管制來顯示，再原位線粒體去極化和細(xì)胞死亡。植烷酸強(qiáng)烈地誘導(dǎo)了ROS的生成，而降植烷酸對(duì)ROS的產(chǎn)生有較弱的影響（Brink等，2006）。

唑康唑、氯三唑、雙芳唑、米康唑和CO，被稱為細(xì)胞色素p-450的強(qiáng)力抑制劑（R..onicke等，2009），因此，也是植烷酸的有效的抑制劑（Komen等，2006）。

植烷酸分解代謝的代謝缺陷已被證實(shí)與許多人類疾病有關(guān)，這些疾病可能導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)和其他器官的致命缺陷（Pahan等，1995）。代謝不佳的植烷酸和降植烷酸的毒性作用是在脂肪組織中積累，包括髓鞘和內(nèi)臟。導(dǎo)致色素性視網(wǎng)膜炎、周邊多神經(jīng)病變、小腦共濟(jì)失調(diào)、腎臟、心臟或肝臟損傷（Zolotov等，2012；Lemotte等，2009）。

6 展望

當(dāng)前，國內(nèi)外研究焦點(diǎn)多數(shù)集中于葉綠素及衍生物在機(jī)體的保健治病作用機(jī)理方面。而作為飼料對(duì)畜產(chǎn)品的影響、動(dòng)物消化代謝等方面的研究還不多，尤其缺乏關(guān)于如何在牧草貯藏、加工過程中減少葉綠素及其衍生物的分解損失方面的研究。這對(duì)在動(dòng)物養(yǎng)殖過程中減少藥物使用，對(duì)生產(chǎn)功能性動(dòng)物飼料及保護(hù)動(dòng)物和人類的健康具有重大意義。

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