高效液相色譜串聯質譜法測定漁業水體及漁業飼料中的五氯苯酚

萬譯文， 黃向榮*， 伍遠安， 李小玲， 肖 維， 楊 霄

（1.湖南省水產科學研究所，湖南長沙410153；2.水產健康生產湖南省協同創新中心，湖南常德415000；3.農業農村部漁業產品質量監督檢驗測試中心，湖南長沙410153）

五氯苯酚（PCP）簡稱五氯酚，是一種毒性較強的氯代酚類化合物，其化學結構穩定不易降解，通過食物鏈進入人體后富集，可造成中樞神經系統、肝腎損傷及內分泌紊亂（譚渝云，1996）。五氯苯酚曾在我國南方血吸蟲病疫區被作為滅螺藥而大量的使用，也有漁民使用五氯苯酚在清塘過程中滅殺雜魚，因此五氯苯酚在水體和環境中殘留還會持續很長一段時間，環境中殘留的五氯苯酚依然會富集到生物體內。

目前已報道的五氯酚檢測方法有：分光光度法（榮寶晶和崔楊卓，2005）、免疫法（Noguera等，2002）、氣相色譜法（胡博等，2015；端禮欽等，2011）、液相色譜法（廖林川等，2004）、氣相色譜-質譜法（史玉坤等，2015）。氣相色譜法是各類物質中五氯苯酚檢測的常用分析方法，由于五氯苯酚沸點高，難于汽化，因此需要進行衍生化處理后才能上機檢測，而在衍生的過程中，對衍生溫度、衍生時間、pH、反應時間等有較高的要求，因此，重現性差且回收率不高。本文旨在建立一種簡單、快速、準確的高效液相色譜質譜聯用測定漁業水體及漁業飼料中五氯酚的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 五氯苯酚標準品（純度大于98.9%），德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、二氯甲烷、甲醇、甲酸（色譜純），德國Merk公司；乙酸銨（色譜純），美國天地公司；Oasis HLB（6 mL/500 mg），美國waters公司；Oasis MAX（6 mL/500 mg），美國waters公司；超純水，美國Milli-Q純水系統制水。

1.2 儀器與設備 TSQ高效液相色譜-串聯四級桿質譜聯用儀，美國Thermo公司；M-X1R高速冷凍離心機，美國Thermo公司；平行旋轉蒸發儀，瑞士Buchi（布奇）公司；MX-S旋渦混勻儀，美國Scilogex公司；固相萃取裝置，美國SUPELCO公司；AUW120D超精密電子天平，日本島津公司；KQ5200超聲波清洗器，昆山超聲波儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制 稱取一定量的五氯苯酚標準品，用甲醇溶解定容配置成100 mg/L的標準儲備液。使用時按照需要用流動相將上述標準儲備液稀釋成一系列不同濃度的標準工作液。

1.3.2 樣品處理 地表水樣品：將采集回來的水樣1 L通過0.45μm水相濾膜過濾待用。準確量取50 mL水樣，置于100 mL離心管中，用甲酸調節pH至2.0左右，渦旋混合30 s。將預處理的水樣在不抽真空的條件下全部轉移至已活化的HLB固相萃取柱中，待水樣全部過完后，加入5 mL純水進行淋洗并吹干，加入4 mL甲醇進行洗脫，收集全部洗脫液，于45℃下氮氣吹干，準確加入1.0 mL甲醇-2 mmol/L乙酸銨溶液（2∶8，V∶V，含0.1%甲酸），漩渦混勻，過0.22μm微孔濾膜后，供液相色譜-串聯質譜測定。

漁業飼料樣品：稱取勻漿后的樣品5.00 g于50 mL離心管中，準確加入氨化乙腈（pH 9～10）10 mL，混勻2 min，放入超聲機里超聲5 min，放入離心機以8000 r/min離心5 min，離心后將上清液轉移至25 mL離心管中，再次加入氨化乙腈提取一次，合并2次提取液并用氨化乙腈定容至25 mL。取5 mL提取液于45℃氮吹至干，加入2 mL 70%甲醇溶液，在漩渦混合儀上充分混合后，加入0.5 g C18吸附劑、0.5 g無水硫酸鎂及0.2 g中性氧化鋁，10000 r/min離心5 min，取上清液經0.2 mm濾頭過濾，HPLC-MS/MS測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱為Capcell Pak C18（MGⅡ，50 mm×2.1 mm，1.9μm）；柱溫為30℃，進樣量為10μL，流動相A為甲醇；B為2 mmoL/L的乙酸銨溶液（含0.1%的甲酸）；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.4.2 質譜條件 采用大氣壓電噴霧離子源（ESI），負離子模式；噴霧電壓為3000 V；毛細管溫度為270℃；鞘氣流速為0.17 L/h；輔助氣流量為0.03 L/h；采用ESI+MRM多反應監測模式進行離子監測，五氯酚的監測離子對、碰撞能量、線性方程及相關系數見表2。

表2 4種化合物的SRM采集參數

2 結果與討論

2.1 地表水前處理條件優化 五氯苯酚在水樣中會進行分子解離和帶電荷，水體中酸堿度大小的變化會改變五氯苯酚的離子化程度，進而影響五氯苯酚在HLB固相萃取柱上的吸附效果。本文采用甲酸和氨水對預處理后的水樣進行調節，比較了pH為1.0～6.0不同酸堿度的水樣，按照“1.3.2樣品前處理”進行操作并上機測定該目標物的回收率后發現當水樣的pH為2.0左右時，五氯苯酚主要以分子形態存在，抑制其電離作用，從而增加萃取效率，提高目標物的回收率。在固相萃取過程中，固相萃取填料的選擇、樣品酸堿度，上樣的速率、洗脫劑的選擇等都會影響固相萃取富集的效率，五氯苯酚結構中有極性較強的羥基使其極性較強，pKa值為4.74。HLB柱是一種親水親脂的反相固相萃取柱，pH為7.5，對親水物質和親脂物質具有均衡的保留能力，適合非極性、弱極性和極性化合物。本文重點研究了常用的C18、HLB、中性氧化鋁等固相萃取柱，研究發現，HLB柱對目標物的萃取效率要高于C18和中性氧化鋁柱，因此，本文選用HLB柱對水樣進行富集和凈化。

2.2 漁業飼料前處理條件優化 目前農藥獸藥殘留常用的提取溶劑有乙腈、乙酸乙酯、甲醇、正己烷等有機溶劑，本文通過五氯苯酚的提取效率來比較這4種常用的有機溶劑。由五氯苯酚的回收率可知，乙酸乙酯對五氯苯酚提取的效率低，回收率為40%～50%；正己烷對五氯苯酚的提取效果較好，常用于對茶葉、飼料等物質中農藥的提取，但是由于飼料中含有豐富的脂肪，而正己烷對脂肪的溶解度大，會加大后期樣品凈化的難度；乙腈和甲醇對五氯苯酚的提取效率也較高，由于甲醇的提取液中含有少量雜質，不利于凈化過程，容易造成色譜柱堵塞。五氯苯酚在堿性環境中溶解度更大，因此本文采用氨化乙腈來提取。

目前，對漁業飼料樣品的凈化多采用固相萃取凈化方式，根據五氯苯酚的結構特征，本文研究了常用的HLB、C18、Oasis MAX 3種固相萃取小柱對五氯苯酚回收率的影響，結果表明，當采用Oasis MAX固相萃取柱時，五氯苯酚的回收率最高，達到90%以上。這是由于HLB和C18小柱為反相固相萃取柱，目標物的極性越大在柱中的保留能力越弱。Oasis MAX柱是一種混合型陰離子交換柱，化合物的pKa值決定了其在MAX柱中的保留能力，只有當化合物的pKa值低于環境的pH時，化合物作為離子化狀態而被柱填料吸附保留。五氯苯酚存在羥基而極性較強，pKa值為4.74，而MAX柱的吸附環境pH為7.0～7.5，五氯苯酚的pKa值小于環境的pH而被吸附保留在柱中，采用酸化甲醇可將五氯苯酚完全的洗脫下來。

2.3 色譜條件的選擇及優化 在液質分析中，流動相多采用甲醇、乙腈和乙酸銨溶液，通過前處理凈化降低色譜的本底值后，采用合適的梯度洗脫程序，能使目標物得到有效的分離和最佳的質譜響應信號。流動相的pH會影響目標物在色譜柱中的分離，本文同時比較了乙腈-水（0.1%甲酸）、甲醇-水（0.1%甲酸）、乙腈-乙酸銨水溶液（0.1%甲酸）、甲醇-乙酸銨水溶液（0.1%甲酸）4種不同的流動相對目標物的電離噴霧影響。試驗發現，當采用甲醇-乙酸銨水溶液（0.1%甲酸）作為流動相時，使目標物色譜峰峰形尖銳、對稱性好，色譜峰的響應強度高。五氯苯酚的SRM色譜圖見圖1。

圖1 五氯苯酚標準溶液（10 ng/mL）的多反應監測色譜圖

2.4 質譜條件的選擇及優化 五氯苯酚苯環上連接著1個羥基[-OH]和5個氯原子，羥基[-OH]容易脫落1個H原子而形成[M-H]-離子峰，采用ESI負離子電離模式，將五氯苯酚標液進行一級全掃描，得到五氯苯酚的母離子。再將目標物的母離子施以碰撞能量得到不同響應強度的二級子離子，選擇豐度最大的作為定量離子，豐度次強的作為定性離子。五氯苯酚標樣中子離子264.7的響應值最大，因此選用264.7作為定量離子。在使用液質法進行檢測時，本方法選擇的子離子均符合歐盟657/2002/EC8規定的識別點要求。進一步優化電壓、碰撞能量、鞘氣與輔助氣流量等質譜條件，使離子質譜響應信號達到最高。

2.5 方法的線性范圍和檢出限 將五氯苯酚標準儲備液用初始流動相稀釋成0.5～50μg/L的標準工作溶液，采用外標法定量，以五氯苯酚的質量濃度（μg/L）為橫坐標，五氯苯酚定量離子的峰面積（Y）為縱坐標來制作標準曲線，可得五氯苯酚的回歸方程和相關系數見圖2。以3倍信噪比確定方法的LOD，10倍信噪比確定方法的LOQ，結合樣品的前處理過程，經過樣品添加試驗計算后得到方法的檢出限和定量限（表3）。

圖2 五氯苯酚標準曲線

表3 五氯苯酚的線性方程、相關系數、檢出限和定量限

2.6 方法的回收率和精密度 取空白水樣和空白漁業飼料樣品，制得濃度為0.1、0.5、1.0μg/L和2.0、10、20μg/kg 3個添加水平的加標樣品，本方法采用外標法定量，按1.3.2節所述條件分別進行添加回收率和精密度試驗。每個添加水平重復測定5次，其平均回收率及相對標準偏差結果見表4。

2.7 實際樣品的測定 對長沙市周邊的養殖魚塘和湖泊等不同來源的地表水和長沙市農貿市場、超市待售的漁業飼料進行處理和測定。由結果可知，有3份養殖水樣中檢出五氯苯酚，其濃度值為0.64～1.22μg/L，說明仍有漁民在養殖過程中使用五氯苯酚作為殺蟲劑。

表4 五氯苯酚在空白樣品中的添加回收率和相對標準偏差

3 小結

本文建立了高效液相色譜串聯質譜法測定漁業水體和漁業飼料中五氯苯酚殘留量的檢測方法。該方法線性關系良好，可在6 min內完成對目標物的分析，水樣和漁業飼料樣品的定量限分別為0.05μg/L和0.8μg/kg；該方法前處理簡單快速、試劑用量少，采用質譜測定結果穩定可靠、準確度與精密度高。