中藥植物雌激素補腎活血化瘀

孫雷 (山東中醫藥大學中醫學院，山東 濟南 250355)

〔關鍵詞〕 補腎；中藥；植物雌激素；活血化瘀；內皮細胞；血管平滑肌；雌激素受體；G蛋白耦聯的雌激素受體

腎氣虧虛是血瘀的重要原因。血瘀多見于中老年人，而腎氣虛亦隨年齡加重。補腎活血化瘀法多用于中醫臨床治療。許多中藥含有植物雌激素，這類物質具有雌激素樣活性，能夠模擬雌激素功能，并可以規避雌激素副作用。近年來，藥理學研究發現，中藥植物雌激素可通過其補腎作用而活血化瘀。

1 中藥植物雌激素的補腎作用

雌激素有補腎的功效，其通過雌激素受體(ER)而發揮作用。經典的ER有細胞內的核受體ER-α及ER-β，并且，二者也見于細胞膜中。近年來，發現了新型的G蛋白耦聯雌激素受體(GPER)〔1～5〕；另外，雌激素與離子通道蛋白的相互結合也已見諸報道〔6〕。植物雌激素廣泛存在于中藥中，可以模擬雌激素的功效，從而起到一定的補腎功效。中藥植物雌激素可見于補虛藥、活血化瘀藥、清熱藥、解表藥、利水滲濕藥、收澀藥及溫里藥等。從分子結構分析，中藥植物雌激素有黃酮類、木脂素類、香豆素類、萜類、甾體類及其他類(如二苯乙烯、真菌源的中藥雌激素、環肽類、酚類)〔7〕。中藥植物雌激素作為雌激素的結構類似物，可與雌激素的各類受體相作用，發揮補腎功效。

2 中藥植物雌激素補腎活血化瘀

雌激素表現中醫學的補腎功效，而雌激素在血管系統中的保健治療作用〔8,9〕已逐漸得到認可。研究顯示，中藥植物雌激素對心血管系統有類似于雌激素的作用〔10〕。中藥植物雌激素可模擬雌激素，發揮血管保護作用，表現一定的補腎活血化瘀功效。

2.1依賴于ER-α及ER-β的活血化瘀

2.1.1增強血管內皮細胞內皮型一氧化氮合酶(eNOS)的活性與表達 血管內皮細胞合成的一氧化氮(NO)有舒張血管、抑制平滑肌增殖、抑制血小板凝集、抑制白細胞黏附血管內皮、抗促動脈粥樣硬化分子氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)的形成等作用。雌激素作用于ER，通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等，提高eNOS的表達與活性水平。中藥植物雌激素可發揮類似作用。

2.1.1.1增強eNOS的活性 人參皂苷Rg3快速(5 min)增強ECV304人內皮細胞中eNOS的磷酸化水平。ER拮抗劑ICI182,780、PI3K抑制劑LY294002阻斷eNOS的磷酸化〔11〕。黃柏苷增強ECV304細胞的eNOS磷酸化，并增強Akt磷酸化，此二者的磷酸化被ER拮抗劑ICI182,780減弱，也為ER-α的siRNA或ER-β的siRNA所減弱，提示ER-α與ER-β都參與該過程，且貢獻相差不大〔12〕。對于苯腎上腺素預收縮的雄性大鼠主動脈環，Rg3表現舒張作用，而ICI182,780、LY294002可將Rg3的舒張作用阻斷〔11〕。人參皂苷Rg3與黃柏苷的作用機制是有差異的：在黃柏苷激活的信號通路中，AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)是PI3K的上游激酶；在人參皂苷Rg3激活ER后，AMPK與PI3K處在不同的通路中。

在內皮細胞EA.hy926中，葛根素〔13〕、白樺脂酸〔14〕同樣快速誘導eNOS蛋白磷酸化，而ER的拮抗可減弱葛根素誘導的磷酸化、抑制白樺脂酸誘導的磷酸化。同時，PI3K的抑制可減弱二者誘導的磷酸化。人參皂苷Rg3、葛根素、白樺脂酸與黃柏苷通過ER激活PI3K/Akt途徑，誘導eNOS磷酸化的能力不同，這體現在ICI-182,780對eNOS磷酸化的抑制程度有別。在8～10周齡大鼠的腸系膜上動脈環中，三七皂苷 Ft1作用于ER而增強eNOS磷酸化。經Ft1誘導而舒張時，動脈環的Akt和細胞外信號調節激酶(ERK)1/2活化，引起eNOS發生磷酸化；ER-β的抑制劑PHTPP削減此三者的磷酸化水平。可見，介導Ft1功能的是ER-β〔15〕。

2.1.1.2增強eNOS的表達 中藥植物雌激素可以誘導eNOS的表達。eNOS磷酸化是非基因的“快速”反應，而eNOS表達的增加需要相對較長的時間才可觀察到。人參皂苷Rg3對ECV304人內皮細胞eNOS磷酸化水平的增強在5 min內發生，而對eNOS表達的增強則在3～24 h觀察到〔12〕。丹參酮ⅡA可誘導大鼠心臟微血管內皮細胞NO合成升高，而此作用被ER拮抗劑ICI182,780所抑制。就eNOS的表達而言，在30 min到12 h的時段中，經10 μmol/L丹參酮ⅡA誘導，eNOS mRNA 的豐度升高60%～70%。eNOS表達的增加為ICI-182,780完全抑制，故依賴于ER〔16〕。芒柄花黃素加強乙酰膽堿對5-羥色胺預收縮大鼠腸系膜動脈的舒張時，血管中eNOS mRNA豐度提高，并且，免疫熒光染色顯示了內皮細胞中eNOS蛋白質水平相應地升高，而ICI182,780、ERK1/2的抑制劑U0126、c-jun氨基末端激酶(JNK)的抑制劑SP600125可抑制這些變化〔17〕。經24 h的誘導，丹參隱酮或漢黃芩素提高了EA.hy926細胞NO的合成，此作用可為ER-α的特異拮抗劑甲基哌啶吡唑(MPP)所阻斷。丹參隱酮、漢黃芩素誘導的eNOS表達增強也被觀察到。丹參隱酮、漢黃芩素還可誘導ER-α的表達升高〔18〕。

2.1.2舒張血管平滑肌 內皮細胞合成的NO進入血管平滑肌，激活游離的鳥苷酸環化酶，催化環鳥苷酸(cGMP)的生成，從而起到舒張血管作用。除此之外，膜結合的鳥苷酸環化酶亦可被中藥植物雌激素激活。雌二醇、白藜蘆醇均可分別激活人冠狀動脈平滑肌細胞的膜結合鳥苷酸環化酶-A，增加cGMP的生成，從而起到舒張血管的作用。此作用為ICI182,780減弱。白藜蘆醇的作用大于雌二醇，而且，ICI182,780未能完全抑制白藜蘆醇的作用，這說明白藜蘆醇激活膜結合鳥酸環化酶-A的作用與ER有關，但不完全依賴于ER〔19〕。其實，白藜蘆醇對心血管系統有多種保健作用，其作用機制是多方面的：雌激素樣活性是其中之一〔20,21〕。

因0.1 μmol/L、1.0 μmol/L染料木素或大豆苷元可增加人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)環氧合酶(COX)-2 mRNA與蛋白質水平，前列環素的生成得以增加，血管平滑肌舒張。ICI182,780的預處理可降低這兩種植物雌激素的作用。不過，在更高的濃度下，染料木素與大豆苷元則無此作用〔22〕。

2.1.3保護血管平滑肌 在大鼠平滑肌細胞中，報告基因分析顯示杜鵑素具有雌激素樣活性，且此活性被ICI182,780所阻斷，但不受ER-α特異性抑制劑MPP影響。結合受體競爭性結合試驗，杜鵑素被證明是ER-β的激活劑。通過活化ER-β，杜鵑素可抑制5%胎牛血清(FBS)誘導的大鼠胸主動脈平滑肌增殖(DNA合成)；ER-β拮抗劑PHTPP能消除杜鵑素的此抑制作用〔23〕。人參皂苷Rb1有效抑制胎牛血清誘導的大鼠血管平滑肌細胞增殖，而ICI182,780幾乎完全消除 Rb1的抑制效果。當ER-β的表達因siRNA的敲減而降低時，Rb1對血管平滑肌細胞增殖的抑制效果相應地出現消減〔24〕。

去甲二氫愈創木酚(NDGA)減弱血管緊張素(Ang)Ⅱ誘發的血管平滑肌細胞增殖，而ER-α的敲減(siRNA技術)或它莫昔芬可逆轉NDGA的作用。NDGA抗血管平滑肌細胞增殖的分子作用(被ER-α敲減或它莫昔芬逆轉)有：肝激酶(LKB)表達及磷酸化水平的增加，AMPK的磷酸化增加，P21、P27、P53表達的增加，增殖細胞核抗原(PCNA)表達的減少等。除此之外，其他兩個發現是，其一，NDGA誘導ER-α表達增加，這可以進一步加強NDGA的雌激素樣活性；其二，將LBK的siRNA引入細胞后，ER-α的表達水平甚至降低到本底水平以下，這提示ER-α與LBK間存在雙向互動關系〔25〕。

葛根素平抑血管平滑肌細胞向成骨細胞的分化，這有賴于ER/PI3K/Akt信號途徑，與雌激素樣活性有關。向分離自小鼠主動脈鈣化血管平滑肌細胞(CVSMC)加入葛根素，Akt磷酸化快速出現，并在15 min左右達到峰值，而后下降。另外，經葛根素處理48 h，堿性磷酸酶活性被抑制。在ICI182,780預處理的情況下，葛根素相關的堿性磷酸酶活性變化與Akt磷酸化幾乎消失〔26〕。7β-羥基膽固醇誘發大鼠血管平滑肌細胞中DNA的片段化與含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3的活性增強，而山柰酚的預處理使得DNA的片段化與caspase-3的活性減弱。ICI182,780 (1 μmol/L)能夠逆轉山柰酚對caspase-3活性的抑制，并可去除山柰酚對DNA片段化的作用〔27〕。對于取自3月齡SD大鼠降主動脈的血管平滑肌細胞，柚皮素有抑制其遷移的作用；該作用為ER-β的特異性抑制劑所阻斷。而且，柚皮素的這一作用未表現與大鼠性別的相關性〔28〕。在血管炎癥誘導因素脂多糖(LPS)的刺激下，A5r7平滑肌細胞的NO合成增強、誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)表達增加；而以依賴ER-β的方式(受ER-β特異性抑制)，丹參隱酮或漢黃芩素能夠降低iNOS及NO升高的幅度。同時，ER-β的表達也因LPS升高，并由丹參隱酮或漢黃芩素的作用而回調〔18〕。

如上所述，植物雌激素阻止血管病理過程中iNOS的表達，防止NO的負面作用。有研究〔29〕發現，植物雌激素提高血管平滑肌iNOS的活性，引起NO合成增加，從而降低血管平滑肌的增殖。在分離自大鼠動脈降支的血管平滑肌細胞中，白藜蘆醇不改變iNOS的蛋白表達，但提升iNOS的活性，使NO生成增多，以抑制細胞的增殖。白藜蘆醇通過提高NOS激活的輔因子四氫生物蝶蛉(BH4)的水平及BH4合成的限速酶GIP環化水解酶-Ⅰ(GTCPH)表達提升iNOS活性。白藜蘆醇的作用與激活ER密切相關，因為ICI182,780大幅消減細胞增殖、iNOS活性、NO生成、BH4的水平及GTCPH表達。

2.1.4保護血管內皮 白藜蘆醇提高NO合成，能夠減輕血管損傷小鼠中新內膜的增生；而在血管損傷的ER-α-/-小鼠中，白藜蘆醇對NO的生成無影響，減輕新內膜增生的作用很小。如此差別的原因有三。其一，就NOS活性的本底水平而言，ER-α-/-小鼠已經遠低于野生型小鼠：提示了ER在NO生成中的地位。其二，在白藜蘆醇誘導下，就eNOS和iNOS的蛋白水平的提高而言，野生型小鼠的升高勝于ER-α-/-小鼠。其三，白藜蘆醇顯著增加野生型小鼠動脈組織中的BH4濃度和BH4合成的限速酶GTP環化水解酶-1(GCH-1)的mRNA水平，但對ER-α-/-小鼠沒有作用〔30〕。

在體外平行平板流室模擬血管層流剪切的條件下，白藜蘆醇誘導男性主動脈內皮細胞(HAEC)增殖和損傷修復，增強ERK的磷酸化；而當ER-α的表達因siRNA敲減而降低 (減少約70.1%)時，白藜蘆醇的作用不再有。不過，白藜蘆醇的這些作用與eNOS未見明顯的相關性〔31〕。

當晚期糖基化終產物(AGE)損傷HUVEC內皮細胞，導致ERK1/2磷酸化、核因子(NF)-κB磷酸化及核定位增加時，毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮的衍生物毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(CG)對其有逆轉作用，而該逆轉作用又為ICI182,780所阻斷。對于AGE刺激HUVEC而引起的炎癥分子高表達，毛蕊異黃酮能逆轉細胞間黏附分子(ICAM)-1、晚期糖基化終產物受體(RAGE)的過度表達，CG能下調單核細胞趨化蛋白(MCP)-1、白細胞介素(IL)-6的過度表達；ICI182,780對毛蕊異黃酮、CG起到拮抗作用。另外，毛蕊異黃酮可增加ER-α的表達，ICI182，780則能阻止ER-α的表達增加〔32，33〕。

染料木素、大豆苷元能夠保護HUVEC，阻止因過氧化氫(H2O2)而出現的HUVEC凋亡及HUVEC增殖抑制，而ICI182,780可消除染料木素、大豆苷元的保護作用。染料木素還有誘導ER-β高表達的作用，而在ICI182,780的拮抗下，ER-β的表達不再被染料木素誘導增高。可見，染料木素、大豆苷元提升內皮細胞ER-β的表達，并作用于ER-β而防止過氧化物誘導的細胞損傷〔34〕。在雄性大鼠外傷性出血模型中，白藜蘆醇降低血管超氧化物的產生。早于白藜蘆醇30 min注射ICI182,780，該保護作用消失。模型大鼠的肺損傷、主動脈的NADPH氧化酶亞基p22phox、p47phox、gp91phox、NADPH氧化酶(NOX)1、NOX4與血紅素加氧酶(HO)-1 mRNA表達的增加、血漿谷草轉氨酶(AST)及谷丙轉氨酶(ALT)水平的升高，均因白藜蘆醇的作用得以回復，而ICI182,780的拮抗則破壞白藜蘆醇的作用〔35〕。

絞股藍皂苷(GP-17)可保護人臍靜脈內皮細胞，減少Ox-LDL誘發的損傷。其一，GP-17可一定程度地回調因Ox-LDL而降低的ER-α表達。其二，GP-17 可提高因Ox-LDL而降低的Akt磷酸化。其三，GP-17可增強Ox-LDL對HO-1及NF-E2相關因子(Nrf)2表達的誘導。其四，GP-17可提高因Ox-LDL而降低的抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)與過氧化氫酶(CAT)的活性，降低因Ox-LDL而升高的丙二醛(MDA)。其五，GP-17可糾正由Ox-LDL引起的Bcl-2表達下降、Bax表達升高及caspase-3的裂解增強。這些保護作用可為ICI182,780所消減〔36〕。丹參酮ⅡA給予去卵巢的apoE-/-動脈硬化雌性小鼠后，雌鼠血清中SOD增加,MDA減少，NF-κB、激活子蛋白(AP)-1、可溶性細胞間黏附分子(sICAM)-1及E-選擇素(selectin)水平下降，血管ERK1/2的磷酸化水平降低。這些變化因ER拮抗劑 ICI182,780而逆轉〔37〕。

2.1.5抗血小板凝集 對于靜息的血小板及膠原激活的血小板，丹參酮ⅡA能夠調節淀粉樣前體蛋白(APP)的裂解方式，從而更多產生可溶性APP(sAPP)α肽，而減少與動脈硬化密切相關的Aβ肽的生成。ER拮抗劑ICI182,780、ER-α特異拮抗劑MPP或PI3K抑制劑LY294002能夠阻斷丹參酮ⅡA的上述效果；在MPP拮抗ER-α的作用存在時，丹參酮ⅡA對PI3K活性及其下游信號分子Akt磷酸化的上調作用減弱，說明丹參酮ⅡA激活ER-α/PI3K/Akt信號途徑，實現對APP裂解的調節〔38〕。

根據Polini等〔39〕的研究，在大鼠動脈條的存在下，染料木素能夠抗腺苷二磷酸(ADP)誘導的血小板凝集；以ICI182,780預處理動脈條，染料木素的抗凝集作用被破壞，提示染料木素作用于動脈條的ER而發揮抗血小板凝集作用。另外，如前所述，染料木素、大豆苷元依賴于ER誘導內皮細胞COX-2表達，促進前列環素生成〔22〕。由此可見，染料木素抗血小板凝集的作用可能有兩方面：染料木素依賴膜ER的“快速”作用，提高NO的生成、前列環素(PGI2)的合成，降低凝血噁烷的生成〔39〕：染料木素依賴ER調節基因表達，合成更多的COX-2〔22〕。

2.1.6血管再生與重塑 通過成骨細胞，薯蕷皂苷元間接誘導內皮細胞增殖。在體外實驗中，薯蕷皂苷元提高小鼠MC3T3-E1培養細胞的血管內皮生長因子(VEGF)-A表達，從而，經薯蕷皂苷元誘導后的MC3T3-E1細胞培養基得以促進人臍帶內皮細胞增殖。薯蕷皂苷元的誘導有賴于ER的作用(為ICI182,780所抑制)，通過激酶src、PI3K/Akt和P38，激活低氧誘導因子(HIF)-1α而實現〔40〕。

通過ER-α/Rho激酶(ROCK)-Ⅱ信號途徑，芒柄花素誘導HUVEC的遷移及應力纖維的形成：這可被ER-α的siRNA或ICI182,780減弱。芒柄花素誘導的ER-α與ROCK-Ⅱ結合也被ICI182,780所破壞。在ER-α的表達被siRNA敲減后，芒柄花素誘導的基質金屬蛋白酶(MMP)2、MMP9表達降低，芒柄花素誘導的肌球蛋白磷酸酶靶亞基(MYPT)1、LIM激酶(LIMK)1、絲切蛋白(cofilin)及肌球蛋白輕鏈(MLC)2的磷酸化降低。在轉基因的斑馬魚模型之腸下血管區域，芒柄花素(50 μmol/L)增加芽體生成和內皮細胞增殖。ICI182,780對芽體生成有一定的抑制作用〔41〕。毛蕊異黃酮促進斑馬魚腸下血管內皮細胞增殖，也促進體外培養的人臍靜脈內皮細胞增殖。在促進內皮細胞增殖時，毛蕊異黃酮提高了內皮細胞中ERK1/2的磷酸化水平。對于毛蕊異黃酮的誘導作用，ICI182,780可消除ERK1/2的磷酸化，而部分減少HUVEC的增殖〔42〕。

如上所述，通過特異性抑制或敲除、敲減等技術，可以將中藥植物雌激素的活血化瘀作用與ER的活性相聯系。近年來，隨著GPER研究的進展，中藥植物雌激素補腎活血化瘀的內容得以更加豐富。

2.2中藥植物雌激素補腎活血化瘀中的GPER 中藥植物雌激素作用于GPER而實現的活血化瘀作用不為ICI182,780所抑制,而且，有研究顯示，ICI182,780可以活化GPER的作用(有種屬特性)〔43〕。現多以G1特異性激活GPER，而以G15、G36為GPER的特異性抑制劑。

與G1的作用機制相類似，原兒茶醛(PCA)通過GPER，改善內皮細胞功能。PCA可提高內皮細胞環腺苷酸(cAMP)水平，減少活性氧，降低由腫瘤壞死因子(TNF)-α誘發的CD-40、血管細胞黏附分子(VCAM)-1、ICAM-1、HIF-1α高表達及NF-κB、P38的磷酸化。在球囊損傷的動脈中，PCA增強再內皮化。同時，PCA還可誘導GPER表達加強。G15表現與PCA、G1相反的作用〔44〕。GPER活化后，反式激活表皮生長因子受體(EGFR)，通過src，Akt、ERK途徑，磷酸化eNOS。Rowlands等〔45〕研究雌馬酚誘導的人臍靜脈內皮細胞eNOS磷酸化，分別以百日咳毒素(PTX)、AG-1478、PP2對G蛋白、EGFR、src進行抑制，觀察到Akt、ERK、eNOS的磷酸化被阻斷或減弱；Rowlands等〔45〕由此認為，雌馬酚的作用是通過GPER實現的。TNF-α誘導eNOS及MMP9的表達，成為內皮細胞的損傷因素。在內皮細胞EAhy926中，芹菜素對二者表達的阻斷與其雌激素樣活性密切相關。芹菜素的此功能既可被ICI182,780逆轉，又因PTX而消減。TNF-α增強蛋白激酶B(PKB)活性而誘導eNOS及MMP9表達增加，芹菜素則降低了TNF-α誘導的PKB磷酸化，而ICI182,780或PTX均有效地消除芹菜素的此作用。ICI182,780對芹菜素作用的逆轉說明了ER的參與；而且，PTX的抑制作用說明了GPER的參與〔46〕。不過，Gi有參與ER的信號傳遞的可能〔47〕；芹菜素并非雌激素，也不能排除芹菜素激活ER及GPER之外的受體而激活Gi/o。若如此，PTX的抑制作用或不能明確GPER參與了芹菜素的功能。

染料木素與GPER有相對較高的親和力(相對親和力約為雌二醇的13%)〔48〕，作用于GPER的可能性較大。染料木素可加強A23187舒張自發性高血壓大鼠主動脈環的作用，染料木素的作用因G蛋白(Gi/G0)、ER-α或表皮生長因子受體的抑制而消減〔49〕。由此分析，ER-α(研究人員認為可能為ER-46)參與了此過程，GPER也有可能參與其中，GPER與ER間或存在協作關系〔50〕。與分離自正常大鼠的肺動脈相比較，從缺氧14 d大鼠分離得到的肺動脈在經苯腎上腺素收縮后，對卡巴膽堿的舒張反應受損。17β-雌二醇、染料木素或大豆苷元均可恢復此舒張反應性，并且，三者的作用同樣被NOS抑制劑阻斷。ICI182,780又對三者的作用均無影響〔51〕。那么，雌二醇的此作用不依賴ER，很有可能是依賴于GPER；染料木素、大豆苷元的作用機制或是類同的。與此相似的研究發現有，在乙酰膽堿誘導苯腎上腺素預收縮的高血壓模型大鼠血管環舒張時，17β-雌二醇、染料木素或大豆苷元也以不受ICI182,780抑制的方式，增強血管舒張〔52〕。

白藜蘆醇誘導豬視網膜小動脈的舒張，有賴于血管內皮合成的NO的作用及不依賴血管內皮的平滑肌自身舒張，而平滑肌的自身舒張因大電導Ca2+激活K+通道的阻斷而被抑制〔53〕。后者與G-1激活GPER而舒張冠狀動脈平滑肌的機制相似〔54〕。雌激素不止作用于熟知的ER，很多的離子通道蛋白可以與雌激素結合〔6〕。可以推測，通過激活這些雌激素“新受體”，雌激素、中藥植物雌激素或者也可發揮補腎活血化瘀的功效。探討中藥雌激素的雌激素樣活性、雌激素“新受體”與活血化瘀間的聯系，研究成果可期。

氣為血之帥，中藥植物雌激素通過補腎而活血化瘀，提示中藥植物雌激素在瘀血證相關疾病中的治療作用〔55〕，從而補腎活血化瘀，降低循環系統的外周阻力。中藥植物雌激素可模擬雌激素的作用，實現補腎活血化瘀的功能，其機制的研究為在中醫理論指導下的新型中藥開發提供了可能。同時，中藥植物雌激素的補腎活血化瘀作用或可為減緩衰老，養生保健提供新的思路。