microRNAs在骨折愈合過程中對成骨細胞的作用

李晨 王鐵軍 譚磊 谷峰 夏永寧 張西正 朱東

(吉林大學第一醫院創傷骨科，吉林 長春 130021)

老年人骨質相對青壯年人更加脆弱，因而在摔傷或交通事故等意外傷害事件中老年人更易受到外力作用而造成骨折。隨著對microRNAs(miR)進行的研究越來越深入，miR對細胞生長與分化的調控作用也越來越受關注。miR在骨代謝中所起到的作用是其中的一個熱點。

1 骨折的愈合

骨折的愈合是一個連續的過程，而且愈合過程非常復雜〔1〕，一般認為骨折愈合包含三個階段：血腫炎癥機化期，原始骨痂形成期，骨板形成塑形期，但這三個階段之間的界限并不完全明確，而是互相包含，逐步推進。在這個過程中，成骨細胞與破骨細胞的協同作用非常重要，成骨細胞的主要作用是合成骨基質，破骨細胞則是吸收骨基質。這兩種細胞的相互作用，使骨的生成和吸收達到動態的平衡，從而保證骨折朝著愈合方向進展。國內外大量研究表明多種miR在成骨細胞的分化及增殖中起到重要調控作用從而影響骨折的愈合。

2 miR的發現、生成及作用機制

miR是在真核生物中發現的一類長度為20～24個核苷酸的內源性具有調控功能的非編碼RNA。自miR于1993年由Lee等〔2〕發現以來，人們對miR進行了深入的研究。發現miR于細胞內起到了多種非常重要的調節作用。一方面，每一個miR有多個目標基因，另一方面，幾個miR也能夠作用于同一個基因。據推測，miR調節著人類三分之一的基因。miR最早于細胞核內開始產生，miR基因首先被RNA聚合酶轉錄，產生一種莖環結構，稱為初始miR(pri-miR),在細胞核中通過多蛋白復合物的加工以產生更短的pri-miR結構。然后精確加工的pri-miR將通過Exportin 5(一種存在于細胞核中的miR運輸蛋白)輸出到細胞核外，并加載到含有核糖核酸酶Ⅲ酶Dicer蛋白，Argonaute蛋白和其他輔助細胞因子的另一臺加工機器上。Dicer將介導pri-miR的切割以形成更加成熟的miR，然后該miR將被Argonaute蛋白結合形成沉默復合體(RISC)，其能夠通過序列互補性調節蛋白表達到mRNA的3′非翻譯區(UTR)的特定區域以調控特定的蛋白質表達〔3〕。

3 部分與成骨細胞相關的miR在骨折愈合過程中的作用及機制

3.1miR-29與成骨細胞 Oskowitz等〔4〕研究表明，在人間充質干細胞(hMSC)分化期間miR的檢測鑒定了19個在成骨分化期間上調的miR。miR-29家族在人類存在于1號染色體和7號染色體，主要包括miR-29a、miR-29b和miR-29c。其中miR-29a位于7號染色體(7q32),miR-29b位于7q32和1號染色體(1q32),miR-29c位于1q32〔5〕。研究表明miR-29通過多個途徑影響成骨。miR-29a對于成骨細胞形成的影響是通過一個正反饋調節Wnt信號傳導通路來進行的：一方面，經典的Wnt通路可以刺激miR-29的表達，另外一方面，miR-29 作用于Wnt通路的抑制因子:Dickkopf相關蛋白(DKK)1、Kremen和Wnt拮抗因子分泌型Frizzled 相關蛋白(SFRP)2，從而進一步促進Wnt信號通路活性和成骨細胞分化〔6〕。研究發現miR-29b通過幾種途徑影響成骨細胞的分化。一方面，miR-29b通過結合其mRNA中的靶3′-UTR序列降低已知的成骨細胞分化抑制劑如組蛋白去乙酰化酶(HDAC)4，轉化生長因子(TGF)β3，激活素A受體(ACVR)2A，β-catenin相互作用蛋白(CTNNBIP)1和雙特異性蛋白磷酸酶(DUSP)2蛋白的表達來促進成骨。另一方面，miR-29b減弱了編碼骨細胞外基質必需蛋白的膠原基因的表達，從而促進礦物沉積〔7〕。miR-29c通過靶向調節蓬亂蛋白(Dvl)2間接促進骨髓間充質干細胞(BMSCs)向成骨分化、礦化能力〔8〕。

3.2miR-138與成骨細胞 研究表明，miR-138通過影響在促進成骨細胞分化中起重要作用的黏著斑激酶，調節hMSC的成骨分化。miR-138在hMSC的成骨細胞分化期間下調。miR-138的過表達在體外可以降低hMSCs的成骨細胞分化，而抗miR-138對miR-138功能的抑制促進了成骨細胞特異性基因的表達、堿性磷酸酶(ALP)的活性和基質的礦物質化。此外，miR-138的過表達使體內異位骨形成減少了85%，相反，當miR-138被拮抗時，體內骨形成增強了60%。以上研究可以說明，miR-138在成骨過程中起負性調節的作用〔9〕。

3.3miR通過作用于runt相關轉錄因子(RUNX)2影響骨折愈合 RUNX2已經被許多研究證明為成骨細胞分化所必需，并在成骨細胞分化中起重要的調控作用。其在成骨細胞的分化中受到許多上游miR調控的同時，又同時調控許多下游miR。構成一個以RUNX2為核心的調控網絡。研究表明〔10～14〕，在這個調控網絡中，miR-23a～27a、miR-204/211、miR-2861、miR-146a、miRNA-20b等都通過作用RUNX2從而參與細胞成骨及骨折愈合。

3.4其他與成骨細胞相關的miR 研究表明miR-335-5p通過下調DKK1激活Wnt信號傳導并促進成骨分化〔15〕。有研究表明，miR-125b對于hBMSCs的成骨分化的調節是通過調節Osx表達來進行的〔16〕。Li等〔17〕研究表明，通過在骨形蛋白態發生(BMP)2誘導的間充質細胞的成骨過程中分析miR，25個響應于BMP2顯著改變的miR中的22個被下調。其中miR-133和 miR-135在成骨分化過程中起到重要作用。王海鵬等〔18〕研究表明miR-30a-5p對于MSCs向成骨細胞的分化具有促進作用。

Mizuno等〔19〕將外源miR-125b轉染進了ST2細胞后，觀察到細胞增殖的抑制和成骨細胞分化的抑制。而當向細胞內轉染miR-125b抑制劑時，結果顯示細胞內的ALP活性升高，由此說明了細胞的成骨分化能力得到了促進。以此證明了miR-125b通過對細胞增殖的影響參與成骨細胞分化。Itoh等〔20〕的研究證明miR-141和miR-200a通過作用于Dlx5并調節Dlx5的表達參與前成骨細胞分化。

國內有學者研究證明，miR-144能夠對MSCs的成骨分化產生抑制作用，相反的miR-451則對成骨分化過程有促進作用〔21〕。Hu等〔22〕研究證明了miR-132-3p可降低Ep300蛋白表達抑制成骨細胞分化。Wei等〔23〕研究表明，在miR-654-5p過表達的hBMSCs中BMP2 mRNA和蛋白表達下調,并且miR-654-5p可通過與特定靶位點結合直接抑制BMP2的mRNA和蛋白表達從而抑制成骨細胞的分化。Kureel等〔24〕研究發現miR-542-3p通過作用于BMP-7抑制成骨細胞分化。Guo等〔25〕研究表明miR-17-92a通過調節Bim在雌激素中的表達在成骨細胞抗凋亡過程中發揮重要作用。

4 總結及展望

綜上，miR通過多個途徑對于成骨細胞的增殖及分化起重要的調控作用從而影響骨折愈合。對miR施加影響來促進成骨細胞的分化及表達從而加速和促進骨折的愈合將成為以后研究方向，從而為老年患者的骨折治療尋找一種新的方法。