苜蓿黃酮的生物活性功能及其在反芻動物中的應用

李苗苗， 靳思玉， 牛志力， 曹 陽

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江大慶 163319）

紫花苜蓿在世界各地廣泛種植，不僅可作為草食家畜的高蛋白粗飼料，還因富含生物活性次級代謝產物在諸多領域（醫學、美容、農業等）備受青睞（Gawel'等，2017； Cornara 等，2016）。 紫花苜蓿次級代謝產物包含大量的黃酮類化合物，目前提取到的黃酮類化合物有50余種（Katarzyna等，2016），干物質基礎上測得總含量達到 （12.6±0.17）mg/g（Karimi等，2013）。提取純化后的黃酮添加到動物基礎日糧中，在機體內充當自由基清除劑和金屬螯合劑（Oskoueian等，2014），發揮殺菌、抗氧化、抗病毒、增強免疫力、調節心血管等功能（Liu 等，2018；Martínez等，2016）。 本文著重對苜蓿黃酮的生物活性和提取工藝進行闡述，同時簡要的分析造成苜蓿黃酮含量差異的因素，旨在為苜蓿黃酮類化合物在畜牧生產上的利用提供理論參考依據。

1 黃酮類化合物分類

根據C3結構氧化程度和B環連接位置的不同，黃酮類化合物主要分為黃酮及其苷類、異黃酮類、異黃烷及其苷類、紫檀烷類、二氫黃酮類、查耳酮類等（Katarzyna等，2016）。黃酮及其苷類的糖基部分主要以葡萄糖或葡萄糖醛酸為主，包含蘆丁、芹菜素、木犀草素、金圣草黃素、苜蓿素、麥黃酮等；異黃酮類主要有芒柄花苷、染料木黃酮、大豆黃素、苜蓿內酯、雞豆黃素A、考邁斯托醇等，該類物質具有類雌激素樣作用；異黃烷及其苷類主要有柚皮素、圣草酚、蒜頭素、維斯體素等；紫檀烷類主要有美迪紫檀素等；查耳酮類主要有異甘草素、甘草素等（趙婭敏等，2103）。苜蓿中最常用的黃酮類化合物主要為芹菜素、木犀草素、苜蓿素。

2 苜蓿黃酮的生物活性功能

2.1 殺菌作用 畜牧生產中抗生素的長期不規范使用導致動物產品抗生素殘留成為亟待解決的問題，開發“天然、綠色”抗菌劑成為研究熱點，黃酮類化合物已被證實具有一定的抑菌作用 （Babii等，2018）。黃酮類化合物主要通過抑制菌體內能量生成（抑制需氧菌糖代謝來抑制三羧酸循環、阻礙病原菌能量攝取、破壞細胞完整性、增加細胞通透性）、抑制菌體內酶活性（抑制拓撲異構酶活性、抑制還原酶/脫氫酶活性）、抑制蛋白質核酸合成等來發揮殺菌作用（楊彩霞等，2014）。通過對提取的苜蓿黃酮進行抑菌試驗發現，其對大腸埃希氏桿菌的最小抑菌濃度（MIC）值為0.40 mg/g，對金黃色葡萄球菌MIC值為0.70 mg/g（董曉寧等，2014）。對7種苜蓿的水醇提取物進行檢測發現，黃酮類化合物含量為5.54～11.67 mg/g，抗微生物潛力的初步測定表明，苜蓿提取物顯示出抗菌活性，對于部分革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌，MIC值分別為31.3 μg/mL 和 125 μg/mL（Rodrigues等，2013）。

2.2 抗氧化作用 紫花苜蓿中含有豐富的黃酮類化合物，其可通過抑制自由基產生和清除自由基反應發揮良好的抗氧化特性。隨著苜蓿黃酮質量濃度增加，其對DPPH自由基的清除速率逐漸增大，當苜蓿黃酮質量分數為1.78 mg/mL時，對DPPH自由基清除率可達到50%；同時通過鐵還原抗氧化能力的方法得出，隨著黃酮濃度增加，Fe2+-TPTZ復合體形成量增加，表現出的鐵還原能力越強，總黃酮質量濃度與鐵還原抗氧化能力呈線性相關，R2=0.9675（劉香萍等，2016）。苜蓿黃酮還具有激活機體抗氧化體系的功能，其可通過增強抗氧化酶活性，提高抗氧化因子合成，激活機體內固有的抗氧化程序，發揮自身抗氧化作用。當機體內氧自由基的產生和清除失衡，過量活性氧的產生和積累導致神經元產生損傷時，抗氧化劑黃酮類化合物也能通過保護神經元細胞免受氧化應激誘導的損傷來發揮抗氧化作用（Xu等，2017）。

2.3 抗腫瘤作用 黃酮類化合物可通過誘導凋亡信號通路的激活，干預凋亡信號傳導途徑，參與細胞周期蛋白調控的方式，誘導腫瘤細胞增殖和凋亡的發生 （Gatouillat等，2014）。人胃癌細胞MGC-803體外培養時加入苜蓿黃酮，發現其可通過下調周期蛋白CyclinD1、CDK4、CDK6的表達，引起細胞周期紊亂，使細胞阻滯在G0/G1期，抑制細胞增殖；然后通過活化促凋亡蛋白Caspase-9、Caspase-3、PARP， 抑制凋亡蛋白 Bcl-2 的表達，誘導細胞凋亡，且這種抑制作用存在著時間和劑量依賴效應（左曉昕等，2016）。黃酮類化合物還可以通過增加胞內Ca2+水平，降低細胞內線粒體膜電位，促進線粒體釋放凋亡誘導因子移位到細胞核發揮凋亡效應（王艷芳等，2003）。

2.4 脂類代謝 食物中脂肪的消化和吸收需要脂肪酶的參與，胰脂肪酶占脂肪分解活性的50% ～70%，而胃脂肪酶占10%～30%，腸道中的三酰甘油被脂肪酶水解轉化為單甘油和脂肪酸后被機體吸收代謝（Birari等，2007）。黃酮類化合物可通過抑制脂肪酶活性減少脂肪分解，降低機體的吸收，阻止肥胖疾病發生。同時也發現脂肪酶活性的抑制與附著于C3位的酰基鏈長度存在直接關系（R2=0.91）（Gonzales等，2015）。

2.5 類雌激素樣作用 含有雜環酚羥基結構的植物雌激素因相似于機體內雌激素結構，能結合體內雌激素受體，發揮較弱的雌激素樣作用。如大豆黃酮和染料木素等均能調節動物體內生長激素、胰島素樣生長因子等激素的分泌，促進動物組織、器官發育；還可以調節垂體促黃體素和促卵泡素等性激素的合成和分泌來影響動物的繁殖性能 （Collins-Burow等，2012）。苜蓿黃酮灌胃性未成熟的雌性大鼠和成年大鼠，在性未成熟的雌性大鼠中，高劑量組促性腺激素釋放激素降低，促卵泡生成素受體的表達量提高，低劑量組黃體生成素和芳香化酶（CYP19A-1）的表達量提高；苜蓿黃酮能降低促成年大鼠中性腺激素釋放激素的表達量，提高促黃體生成素受體和CYP19A-1的表達量。苜蓿黃酮可通過下丘腦-垂體-卵巢性腺軸產生負反饋調節，并通過負反饋調節機制抑制促性腺激素釋放激素的表達，影響機體性腺軸上其他相關基因的表達，從而發揮類雌激素樣作用（王偉等，2014）。

2.6 增強免疫力 黃酮類化合物通過作用于機體免疫器官、調節垂體生長激素的分泌、刺激免疫細胞抗體的合成，調節體液免疫和非特異性免疫，改善機體的免疫機能，進而提高免疫力。在小鼠日糧中添加適量黃酮，可促進小鼠DNA和蛋白質合成，加速細胞的增殖，通過IFN-γ mRNA的高表達和IFN-γ的高分泌，激活NK細胞，刺激B細胞分泌抗體，增強機體免疫調節的能力 （唐浩國等，2007）。在LPS誘導下，苜蓿黃酮可能通過抑制 TLR2/MyD88/p38信號，降低 TNF-α、IL-1β 和IL-6等炎癥因子基因的表達量，保護細胞免受炎性損傷（占今舜等，2018）。

3 苜蓿黃酮常用提取工藝

苜蓿中黃酮類化合物常用的提取工藝主要有有機溶劑浸提法、超聲波輔助提取法、超聲波輔助提取法。

3.1 有機溶劑浸提法 有機溶劑浸提法提取工藝簡單、操作方便、條件容易控制、設備費用較低、提取劑容易消除、工業化可行性強，但提取效率低、試劑損耗大。尹衛等（2016）采用醇提法，以單因素試驗及正交試驗方法確定苜蓿黃酮類物質提取效果因素由大到小依次為料液比、乙醇濃度、提取溫度，并優化最佳提取工藝為料液比1∶20、提取溫度70℃、乙醇濃度70%，黃酮類物質提取量為0.0237 mg/mL。

3.2 超聲波輔助提取法 超聲波提取法是采用超聲波的強烈振蕩、空化效應和熱效應的原理，使樣品處于高溫高壓的環境，隨著激波的產生，細胞受壓破碎，釋放胞內物質，致使目標物質溶解在溶劑的過程。超聲輔助提取是從紫花苜蓿中獲得黃酮的有效方法，與常規提取方法相比，使用超聲輔助提取的提取物中總黃酮含量和抗氧化活性更高（Jing 等，2015）。劉香萍等（2016）通過響應面法優化超聲波輔助提取苜蓿黃酮工藝得出，乙醇體積分數65%、提取溫度67℃、超聲波功率100 MHz、提取時間40 min時，黃酮的得率為5.29 mg/g。許英一等（2018）采用乙醇浸提、超聲波輔助水提取和超聲波輔助乙醇提取3種方法進行苜蓿黃酮的提取發現，總黃酮得率分別為（4.32±0.08）、（4.59±0.08）、（5.44±0.12）mg/g， 對超聲波輔助乙醇提取黃酮的工藝進行優化后得出，苜蓿黃酮的得率達到6.43 mg/g。超聲波輔助提取技術提取時間短、操作簡便、適應性廣泛、提取效率相對較高、提取物中純度較大，但其提取工藝噪聲污染嚴重。

3.3 微波輔助提取法 微波輔助提取通過強大的穿透能力到達樣品的微管束和腺胞系統，在細胞內部產生高壓高溫破壞細胞屏障，釋放細胞內容物。微波輔助提取具有適用范圍廣、目標選擇性強、需求設備簡便、萃取效率高、節省時間和萃取所需試劑污染較小、試驗重復率高等特點。黃曉慧等（2017）通過單因素和正交試驗設計，得到優化微波輔助提取苜蓿黃酮的工藝為提取時間30 min、乙醇濃度60%、微波功率600 W、固液比1∶15、提取溫度80℃。張羽男等（2014）采用微波輔助提取法提取苜蓿黃酮，確定其最佳工藝為pH 10.0、固液比1∶50、功率140 W、提取時間30 s，提取率為14.587 mg/g。

4 苜蓿黃酮含量的差異

植物次級代謝物含量和生物活性如抗氧化活性、抗炎癥等呈正相關（Barros等，2007），并可在一定范圍內受植物生長環境的調節。其中，黃酮的含量因土壤類型、日照、降雨等因素在個體中差異較大（Pandey等，2009）。鹽度是能夠改變植物中多酚化合物含量的主要因素之一，高鹽度的土壤可誘導植物抗氧化酶活化和抗氧化化合物的合成增加（Gupta等，2014）。研究表明，植物生長土壤的NaCl濃度增加后，黃酮類化合物含量有所增加（Colla等，2013）。也有研究表明，隨著紫花苜蓿植株的生長總黃酮含量逐漸下降，結實期顯著低于前面各個時期，并且以4年生紫花苜蓿中黃酮含量最高（高微微，2004）。采用不同光質和光照時間處理紫花苜蓿芽苗發現，白光最有利于紫花苜蓿黃酮類化合物的積累，且光照4～8 h時有利于黃酮類化合物的產生（馮娜娜，2016）。適當的干旱也有利于黃酮類化合物生物合成基因的表達，對于苜蓿黃酮類化合物的積累起到促進作用（Kang，2011）。

5 苜蓿黃酮在反芻動物方面的應用

5.1 在牛日糧中的應用 動物日糧中添加黃酮類化合物，其結構酚羥基氫原子可與過氧自由基相結合生成黃酮自由基，再與其他自由基發生反應終止自由基鏈式反應，提高動物機體清除自由基和抗氧化能力；同時黃酮類化合物可通過降低動物血液黏度和紅細胞凝聚性，促進血液循環，提高糖、脂和蛋白質等營養物質代謝，從而促進營養物質的相互轉化，促進體內蛋白質等營養物質合成，提高機體的非特異性免疫。

在奶牛基礎日糧中添加60 mg/kg BW苜蓿黃酮發現，其可通過調節對蛋白質的吸收和代謝，改變牛奶的成分，調節瘤胃中的微生物群體以增加營養物質消化的趨勢，提高谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活性以改善抗氧化性，抑制淋巴細胞的凋亡以及調節血液中中性粒細胞和淋巴細胞的數量，從而改善奶牛的非特異性免疫（Zhan 等，2017）。

5.2 在綿羊日糧中的應用 在綿羊基礎日糧中添加苜蓿黃酮提取物發現，其可通過提高谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶、生長激素和胰島素生長因子的量，調節綿羊的抗氧化性能和激素分泌，促進機體生長（王凱等，2017）。在薩福克小尾寒羊雜交羊基礎日糧中添加苜蓿黃酮發現，其可調節綿羊脂類代謝，提高氮的利用效率，維持體內能量代謝及鈣磷平衡，其血清中總抗氧化能力、超氧化物歧化酶、超氧陰離子清除能力和羥基自由基清除能力有升高趨勢，具有促進動物生長的潛能。建議添加量為0.2%（劉艷豐等，2016；王夢竹等，2015）。

6 小結

盡管紫花苜蓿黃酮廣泛用于傳統醫學治療多種疾病，但到目前為止大多數研究都在體外進行，對體內的研究相對較少，且部分活性理論還未完全闡明，還沒有足夠的臨床證據表明其效果。因此，需要標記物來標準化的分析活性化合物的功效。未來的研究應側重于樣品制備技術和分離工具的開發和應用，以便分析苜蓿提取物發揮功效的主要成分。因此，開發用于純化單個生物活性化合物的先進方法將便于將來能夠闡述其對動物有機體的作用機制。來自樣品測定數據，動物模型研究以及使用標準化提取物或單個化合物的可靠臨床試驗對于證實其活性和確定有效劑量是必要的。