地衣芽孢桿菌YC10發(fā)酵液對辣椒疫霉的抑制作用試驗(yàn)初報

趙嚴(yán)港

摘 要 測定了一株地衣芽孢桿菌YC10發(fā)酵液對辣椒疫霉菌的抑制率、菌絲的生長及游動孢子釋放和萌發(fā)的影響。結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌YC10發(fā)酵液對辣椒疫霉菌具有一定的抑制作用，抑制率達(dá)78.67%;可導(dǎo)致病原菌菌絲畸形、分支增多及原生質(zhì)濃縮;對辣椒疫霉游動孢子釋放和萌發(fā)的相對抑制率為36.91%和57.14%，與對照相比明顯抑制了游動孢子的釋放和萌發(fā)。

關(guān)鍵詞 地衣芽孢桿菌;辣椒疫霉;抑制作用

中圖分類號：S476 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.27.065

辣椒疫病是辣椒生產(chǎn)上的一種毀滅性病害，于1918年在美國新墨西哥州首次發(fā)現(xiàn)，我國江蘇省于1940年報道此病的發(fā)生。辣椒疫病的流行發(fā)生，常導(dǎo)致植株成片死亡，損失嚴(yán)重，露地和保護(hù)地均發(fā)生，一般病株率為15%～30%，嚴(yán)重時達(dá)80%以上。同時，辣椒疫病在美國、加拿大、韓國等國家嚴(yán)重發(fā)生，均造成不同程度的損失[1-4]。辣椒疫病的發(fā)生給我國及世界各國的農(nóng)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，這使得有效防治此病的發(fā)生成為目前的主要任務(wù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和培養(yǎng)基

辣椒疫霉和地衣芽孢桿菌YC10，由微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供;辣椒疫霉菌培養(yǎng)用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PD）和V8培養(yǎng)基;地衣芽孢桿菌YC10發(fā)酵用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（NA）和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NB）。

1.2 地衣芽孢桿菌YC10發(fā)酵液的制備

采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)法。地衣芽孢桿菌YC10在NA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)后，挑取單菌落于5 mL NB液體培養(yǎng)基中，28 ℃，120 r·min-1，過夜培養(yǎng)。取菌液按1∶50的比例接種到NB培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)24 h。將地衣芽孢桿菌YC10發(fā)酵液在10 000 r·min-1，4 ℃條件下離心20 min，取上清液用細(xì)菌過濾器（濾膜孔徑0.22 μm）除菌，即得無菌濾液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 地衣芽孢桿菌YC10發(fā)酵液對辣椒疫霉的抑制作用

取1 mL地衣芽孢桿菌YC10無菌濾液與20 mL PDA培養(yǎng)基混勻，倒入培養(yǎng)皿，制備平板。將直徑為5 mm的辣椒疫霉菌塊接種于平板中央，28 ℃培養(yǎng)72 h，以不加無菌濾液的培養(yǎng)基培養(yǎng)的辣椒疫霉菌為對照。采用垂直十字法測量菌落直徑，按公式（1）計算抑菌率。

1.4 地衣芽孢桿菌YC10發(fā)酵液對辣椒疫霉菌絲形態(tài)的影響

按照吳輝等[5]的處理方法，在無菌條件下，用打孔器（直徑8 mm）打取辣椒疫霉菌塊，接種于50 mL PD培養(yǎng)基中，28 ℃，120 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 d。將形成的辣椒疫霉菌球置于無菌培養(yǎng)皿中，再將制備的地衣芽孢桿菌YC10發(fā)酵液按1∶5的比例倒培養(yǎng)皿中，分別以無菌水和NB液體培養(yǎng)基為空白對照，28 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2 d。用接種針挑取懸浮在液體中的辣椒疫霉菌絲少許，用無菌水沖洗2～3遍后涂布玻片，置于倒置顯微鏡下觀察。

1.5 地衣芽孢桿菌YC10發(fā)酵液對辣椒疫霉游動孢子釋放和萌發(fā)的影響

將在V8培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d的辣椒疫霉置于無菌水中，配制成濃度為105個/mL孢子囊懸浮液，將孢子囊懸浮液與地衣芽孢桿菌YC10發(fā)酵液按1∶1（體積比）的比例混合于無菌EP管中，以無菌水為空白對照。在4℃條件下黑暗處理6 h，促進(jìn)游動孢子釋放和萌發(fā)，于光學(xué)顯微鏡下觀察游動孢子釋放和萌發(fā)情況并計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 地衣芽孢桿菌YC10發(fā)酵液對辣椒疫霉的抑制作用

采用固體平板法，測量地衣芽孢桿菌YC10發(fā)酵液對辣椒疫霉菌絲生長抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)YC10的發(fā)酵液對辣椒疫霉菌絲生長的抑制效果最明顯，抑制率達(dá)到了78.67%。由圖1可以看出，在含有YC10發(fā)酵液的培養(yǎng)基上辣椒疫霉生長緩慢，只生長出非常稀薄的基內(nèi)菌絲，而對照培養(yǎng)基上辣椒疫霉正常生長。

2.2 地衣芽孢桿菌YC10發(fā)酵液對辣椒疫霉對菌絲形態(tài)的影響

由圖2可以看出，用無菌水處理的辣椒疫霉菌絲正常生長，菌絲形態(tài)飽滿，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為清晰，分枝少且徑粗一致（圖2a）。經(jīng)地衣芽孢桿菌YC10發(fā)酵液液處理后，辣椒疫霉菌絲形態(tài)發(fā)生明顯變化，菌絲畸形，分支增多，并伴隨有明顯的原生質(zhì)濃縮等現(xiàn)象（圖2b、c）。

2.3 地衣芽孢桿菌YC10發(fā)酵液對辣椒疫霉游動孢子釋放和萌發(fā)的影響

由表1和表2可以看出，地衣芽孢桿菌YC10發(fā)酵液對辣椒疫霉游動孢子釋放的相對抑制率為36.91%，對游動孢子萌發(fā)的相對抑制率為57.14%，與對照相比明顯抑制了游動孢子的釋放和萌發(fā)。

3 小結(jié)與討論

地衣芽孢桿菌是一種土壤中常見的革蘭氏陽性嗜熱菌，可以產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，并具有獨(dú)特的生物奪氧作用機(jī)制，能抑制病原菌的生長繁殖。本研究從辣椒根際土壤中分離到了地衣芽孢桿菌YC10，研究發(fā)現(xiàn)其對辣椒疫霉菌具有較強(qiáng)的拮抗作用。同時發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌YC10的發(fā)酵液顯著影響辣椒疫霉菌的菌絲形態(tài)，抑制了菌絲的生長和擴(kuò)展，降低了游動孢子的釋放和萌發(fā)率，阻止了病原菌的進(jìn)一步侵染。本研究中地衣芽孢桿菌YC10產(chǎn)生的活性物質(zhì)是如何抑制病原菌的生長、如何定殖寄主根部等防病機(jī)理還需要進(jìn)一步研究，對于其在生產(chǎn)上的應(yīng)用效果也有待于深入探索。

參考文獻(xiàn)：

[1] Lee K， Kamala-Kannan S， Sub H， et al. Biological control of Phytophthora blight in red pepper （Capsicum annuum L.） using Bacillus subtilis[J]. World J Microbiol Biotechnol.2008，24：1139-1145.

[2] 汪濤，遲元凱，趙偉，等.多粘類芽孢桿菌TC35的鑒定及對辣椒疫病的田間防效[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（4）：138-139.

[3] 邱思鑫，阮宏春，宋美仙，等.內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌TB2菌株活性物質(zhì)誘導(dǎo)辣椒果抗疫病的生化機(jī)理[J].熱帶作物學(xué)報，2010，31（10）：1813-1820.

[4] 楊琦瑤，索雅麗，郭榮君，等.枯草芽孢桿菌B006對黃瓜枯萎病菌和辣椒疫霉病菌的抑制作用及其抗菌組分分析[J].中國生物防治學(xué)報，2012，28（2）：235-242.

[5] 吳輝，潘夢武，高易紅，等.辣椒疫病生防菌的篩選、鑒定及其抑菌機(jī)理初探[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54（7）：1596-1599.

（責(zé)任編輯：趙中正）