黨參多糖的分離純化及抗衰老作用研究

張 濤， 楊婉羚， 曹 喻， 董澤令， 閔 迅

(1.遵義醫學院檢驗醫學院，貴州遵義 563000； 2.遵義醫學院附屬醫院檢驗科，貴州遵義 563003)

多糖也稱聚糖，是由多種單糖如葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸等，通過脫水連接在一起的生物大分子[1]。研究表明，多糖是中草藥的有效成分之一，具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調節等多種生物活性[2]，是構成植物細胞壁的主要成分，一般采取熱水煮提法獲得多糖，試驗操作方便，對于多糖分子的結構破壞性較小，產率較高。

黨參(CodonopsispilosulaNannf.)是我國傳統的中藥材，且藥食兩用，具有抗氧化、補氣補血、抗腫瘤、免疫調節等活性[3]。研究表明，黨參的活性成分包括多糖、甾醇類等活性分子[4]。對黨參主要成分多糖的研究自20世紀80年代就已開展，發現黨參多糖具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調節等活性[5]，如經黨參多糖處理后衰老模型小鼠的血清中丙二醛和腦中褐質含量下降明顯，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性上升明顯，推測黨參多糖抗衰老與其清除自由基及抗脂質過氧化相關[6]。但是目前關于黨參抗氧化活性方面的研究不全面，黨參多糖中的主要抗氧化活性成分不完全明確，阻礙了黨參多糖的結構及藥理活性研究。本試驗通過提取、分離純化及體內外抗衰老活性試驗，對黨參多糖進行了較為系統的研究，能夠促進黨參多糖類抗衰老藥品的開發利用。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

黨參購于貴州仙龍藥業有限公司；牛血清白蛋白級分V購于羅氏公司；間羥基聯苯、氨基磺酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)購于Sigma公司；三氟乙酸購于國藥集團；D-半乳糖(D-Gal)、乙醇、苯酚、濃硫酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、乙酸鈉、氯化鈉和維生素C等購于北京化工廠；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒和過氧化氫酶(CAT)試劑盒購于上海索寶生物公司。昆明系小鼠購于第三軍醫大學。

1.2 儀器與設備

可見分光光度計(723型)購于上海光譜儀器有限公司；電子天平(ME104)購于梅特勒-托利多公司；冷凍干燥器購于北京博醫康實驗儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋購于北京泰澤瑞達科技有限公司；蘭格蠕動泵(BT01-100)購于保定蘭格恒流泵有限公司；自動部分收集器(BS-100A)購于上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 黨參多糖的制備

稱取500 g黨參，洗凈后，先后分別于100 ℃ 8 L及 100 ℃ 6 L蒸餾水中連續煮提2次，每次煮提4 h。將提取液濃縮至約700 mL，離心后收集上清并加入4倍體積的95%乙醇進行沉淀，離心收集多糖沉淀，利用Sevag法除蛋白后凍干，即得黨參多糖(CodonopsospilosulaNannf. pdysaccharide，簡稱CPNP)。

1.4 黨參多糖的分離純化

稱取20 g的黨參多糖溶于200 mL蒸餾水中，上樣于DEAE-纖維素離子交換柱(8.0 cm×20 cm，Cl-型)。依次用蒸餾水(2 L)、0.1 mol/L NaCl(2 L)和0.3 mol/L NaCl(2 L)進行洗脫，流速12 mL/min，每200 mL洗脫液收集1次。采用苯酚-硫酸法檢測洗脫液中的糖含量。根據糖含量的分布圖，收集適當的洗脫液，經蒸餾水透析除鹽后，凍干備用。

1.5 多糖的單糖組成分析

稱取多糖約2 mg于水解小瓶中，加入1.0 mL 2 mol/L的三氟乙酸溶液(TFA)，于120 ℃水解5 h；將水解產物轉移至蒸發皿中，加入適量的無水乙醇，蒸干，除掉三氟乙酸；用超純水復溶蒸干的水解產物，經0.22 μm濾膜過濾后，待離子色譜分析；采用Thermo ICS-5000+配備脈沖安培檢測器，離子柱為Carbo PAC PA20(3.0 mm×150 mm)。根據Liang等建立的淋洗條件進行檢測，流速0.4 mL/min，柱溫28 ℃[7]。

1.6 黨參多糖的分子量分布分析

稱取多糖約2 mg，溶于0.2 mol/L NaCl溶液，經0.22 μm濾膜過濾后，待高效凝膠滲透色譜(high performence gel permeation chromatography，簡稱HPGPC)分析。標準品聚糖系列，平均分子量分別為12、50、150、270、410、670 ku。以上述標準聚糖的常用對數為縱坐標，相應的保留時間為橫坐標作圖，繪制標準曲線。根據標準曲線及多糖的保留時間計算出多糖的分子量。采用島津LC-20AT系列高效液相色譜儀配備示差折光檢測器，分子篩柱為TSK-gel G4000PWXL(7.8 mm×300 mm)，流動相為0.2 mol/L NaCl水溶液，流速為0.5 mL/min。

1.7 體外抗衰老試驗

1.7.1 對DPPH的清除能力 將黨參多糖的子級分溶于蒸餾水中，配成不同濃度的溶液(0～4.0 mg/mL)。取不同濃度的多糖溶液4 mL分別與1 mL DPPH溶液(0.1 mol/L)混合，避光孵育20 min。空白對照為蒸餾水，陽性對照為維生素C。DPPH清除率=(1-D多糖/D蒸餾水)×100%，其中D多糖和D蒸餾水為溶液在517 nm處的吸光度[8]。

1.8 衰老模型小鼠試驗

選擇體質量20～25 g雄性小鼠30只，隨機分為蒸餾水空白組、衰老模型對照組、黨參多糖組，每組10只。3組于皮下注射D-半乳糖(生理鹽水配成5%)構建衰老模型小鼠[10]，連續40 d。黨參多糖灌胃劑量為400 mg/kg，另2組灌胃同體積蒸餾水。連續灌胃30 d，末次灌胃2 h后，小鼠眼眶取血，測定血SOD和CAT的活性，結果計算按試劑盒說明進行。

2 結果與分析

2.1 黨參多糖的分離純化

利用DEAE-纖維素柱對黨參多糖進行分離純化，分別用0、0.1、0.3 mol/L的NaCl溶液對黨參多糖進行梯度洗脫，結果發現得到黨參多糖子級分多糖-1(CodonopsispilosuiaNannf. sub-polysaccharide-1，簡稱CPNP-1)和黨參多糖子級分多糖-2(CodonopsispilosuiaNannf. sub-polysaccharide-2，簡稱CPNP-2)2個級分的產率分別為 30.6% 和19.8%，二者均富含糖醛酸(圖1)。

2.2 黨參多糖級分CPNP-1和CPNP-2的單糖組成

采用高效離子色譜法檢測黨參多糖各級分的單糖組成，結果發現，黨參多糖的子級分CPNP-1主要含有19.8%半乳糖醛酸(galacturonic acid，簡稱GalA)、23.9%半乳糖(galactose，簡稱Gal)、22.1%阿拉伯糖(arabinoss，簡稱Ara)和26.7葡萄糖(glucose，簡稱Glc)，還含有4.6%鼠李糖(rhamnose，簡稱Rha)和2.9%葡萄糖醛酸(glucuronic acid，簡稱GlcA)。CPNP-2主要含有GalA(32.2%)、Rha(17.9%)、Gal(17.2%)和Ara(28.3%)，以及少量的Glc(2.1%)和GlcA(2.3%)；二者Rha/GalA的比例分別為0.23和0.56，均在Ⅰ型-鼠李半乳糖醛酸聚糖(rhamngalacturonan Ⅰ，簡稱RG-Ⅰ)型果膠的定義范圍之內(0.05～1.0)[11](圖2)。推測CPNP-1和CPNP-2都屬于RG-Ⅰ型果膠，并且可能帶有Ⅰ/Ⅱ型-阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan Ⅰ/Ⅱ，簡稱Ⅰ/Ⅱ-AG)側鏈。

2.3 黨參多糖級分CPNP-1和CPNP-2的分子量

利用高效凝膠排阻色譜聯合TSK-gel G4000PWXL分子篩對DEAE-纖維素柱分級得到的CPNP-1和CPNP-2分子量進行分析。結果發現，CPNP-1和CPNP-2的分子量分別約為51、23 ku，且均一性良好，CPNP-2呈現對稱且較窄的峰型(圖3)。

2.4 黨參多糖體外抗衰老活性

對黨參多糖子級分CPNP-1和CPNP-2的DPPH清除能力進行分析，結果發現，CPNP-1和CPNP-2都具有良好的DPPH自由基和超氧負陰離子的清除能力，且活性隨著2種多糖濃度的增加而增強，呈現一定的濃度依賴性。在多糖濃度為0～4mg/mL的范圍內，CPNP-1的DPPH自由基和超氧負陰離子50%有效的清除濃度分別3.6、2.1 mg/mL；CPNP-2的自由基和超氧負陰離子50%有效的清除濃度分別為1.3、0.9 mg/mL。CPNP-2的DPPH自由基和超氧負陰離子的清除能力均強于CPNP-1(圖4)。

2.5 衰老模型小鼠試驗

通過建立衰老模型小鼠，檢測血清中SOD和CAT的活性，進而分析黨參多糖子級分CPNP-2的活性，結果如表1所示。與衰老模型對照組相比，CPNP-2組血清中SOD和CAT活性顯著升高(P<0.01)，且與蒸餾水空白對照組差異不明顯，表明黨參多糖子級分CPNP-2可以緩解衰老模型小鼠血清的SOD和CAT活性下降。

3 結論與討論

表1 衰老模型小鼠各組血清中SOD和CAT活性

注：**表示與模型組比較差異極顯著(P<0.01)。