羊抗人ApoB高效價抗血清制備方法的建立與優化

徐志偉， 徐小波， 于建寧， 劉偉忠

(1.江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所，江蘇句容212400；2.江蘇省農業科學院畜牧研究所/農業部種養結合重點實驗室，江蘇南京 210014)

載脂蛋白(apolipoprotein，簡稱Apo)是指血漿脂蛋白中的蛋白質部分，Apo既是脂蛋白的構成部分，又具有穩定脂蛋白的功能，同時能修飾并影響與脂代謝有關的酶活性[1]。ApoB與膽固醇組成低密度脂蛋白(low density lipoprotein，簡稱LDL)，能識別LDL受體，介導LDL代謝[2-3]，所以ApoB在維持體內血脂恒定、脂類代謝與轉運中發揮重要作用。因此，人ApoB的檢測在糖尿病、冠狀動脈綜合征等心血管疾病的診斷和臨床治療方面具有重要意義[4-5]。可通過測定ApoB反映低密度脂蛋白指標，而且ApoB/ApoA1的值是動脈粥樣硬化等疾病預測和診斷的重要參考。測定載脂蛋白及脂蛋白對分析心血管類疾病的狀態很有價值[4]。然而用于檢測ApoB的試劑盒尚不成熟，其難點是制備高效價和高特異性的免疫血清，目前通過大動物免疫獲得血清中的抗體效價一般都不高，提高抗體效價的研究是很有價值的。

本試驗研究用人ApoB抗原免疫湖羊，通過不同免疫劑量、不同免疫途徑及不同羊年齡的比較，形成并優化羊抗人ApoB高效價抗血清的制備方法，以期為規模化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗羊與試驗期 試驗在江蘇省句容市行香羊場實施，試驗期(含預試7 d)為2017年5月8日至2017年6月20日。選擇該羊場健康湖羊公羊，幼年羊10頭(6～10月齡，平均7.4月齡，平均體質量42.4 kg)；成年羊70頭(15～22月齡，平均18.6月齡，平均體質量50.9 kg)；老年羊10頭(28～42月齡，平均35.1月齡，平均體質量62.9 kg)。為利于羊身體健康和獲得好的試驗效果，采用放牧和舍飼相結合的飼養方法，白天放牧4 h，上午、下午各2 h，晚上飼喂精料1次，15 d 后開始試驗。

1.1.2 抗原與佐劑 ApoB抗原購自元升生物科技(上海)有限公司，純度為96%；完全弗氏與不完全弗氏佐劑購自Sigma公司。

1.2 試驗設計

1.2.1 不同免疫劑量比較 將30頭成年羊按月齡和體質量平均分為3組；免疫途徑為皮下多點注射，注射點分別為腹股溝3個點、肘部2個點、頜下1個點、背側2個點、耳后1個點，2側共計18個點；抗原量分別為第1組0.2 mg/(次·頭)，第2組0.4 mg/(次·頭)，第3組1.0 mg/(次·頭)，無論抗原量多少，均統一用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，簡稱PBS)+完全弗氏與不完全弗氏佐劑乳化成2 mL量；免疫程序：共計5次免疫，第1次、第2次間隔15 d，第2次至第5次均間隔7 d。

1.2.2 不同免疫途徑比較 試驗羊分組與不同免疫劑量比較試驗相同，免疫劑量均為0.4 mg/(次·頭)；免疫程序同“1.2.1”節；免疫途徑：第1組為肌肉多點注射，后腿肌肉群3個點、前腿肌肉群2個點、頜下1個點、背側2個點、耳后1個點，2側共18個點；第2組為皮下多點注射同“1.2.1”節；第3組為皮內+淋巴多點注射，第1次免疫18個點位置同“1.2.1”節(皮下改成皮內)；第2次免疫18點的同時，另加2側腹股溝淋巴結，共20個點；第3～7次免疫仍然免疫18個點。

1.2.3 不同羊年齡比較 試驗羊分為3組，分別為幼年羊組、成年羊組、老年羊組，每組10頭羊；免疫劑量為 0.4 mg/(次·頭)；免疫途徑和免疫程序同“1.2.1”節。

1.3 免疫羊觀察與抗體監測

每天觀察羊的動態，采食情況，精神狀況，作好記錄。每組試驗羊隨機抽取5頭羊，在免疫前、二免前、三免前、五免后5 d分別采血并采用酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，簡稱ELISA)法進行抗體檢測，作好記錄。

1.4 血清制備與抗體效價測定

待血液凝固之后，在超凈工作臺中用無菌滴管把血塊剝離瓶壁，在37 ℃條件下放置1～2 h，放入4 ℃冰箱過夜，血清充分析出后經離心沉淀分離出血清，放進-20 ℃低溫冰箱保存。

抗血清效價測定采用常規的瓊脂擴散方法。設定標準陽性血清孔和陰性孔，標準陽性血清孔和抗原孔之間出現明顯的致密白色沉淀線，而陰性孔則不出現。

2 結果與分析

2.1 不同免疫劑量對免疫效果的影響

對0.2、0.4、1.0 mg/(次·頭)3個免疫組，分別于免疫前、二免前、三免前、五免后檢測血清中抗體效價，從表1可以看出，二免疫前，0.2 mg/(次·頭)組抗體效價為1 ∶25～1 ∶26，隨后逐漸升高到1 ∶28；0.4 mg/(次·頭)組明顯高于其他2組，五免后達到1 ∶28～1 ∶29；而1.0 mg/(次·頭)組二免疫前略高于0.2 mg/(次·頭)組，但三免前、五免后明顯低于0.2 mg/(次·頭)組。

表1 不同免疫劑量抗體效價比較

2.2 不同免疫途徑對免疫效果的影響

肌肉多點、皮下多點、皮內+淋巴3種免疫途徑的抗體產生規律見表2，肌肉多點免疫法抗體產生效率最低，二免前大多為1 ∶25，三免前大多為1 ∶26，五免疫后平均達不到 1 ∶27；皮下多點及皮內+淋巴的方法免疫效果接近，從二免前開始抗體效價就明顯高于肌肉多點組，至五免后80%的羊抗體效價達到了1 ∶29，且皮下多點與皮內+淋巴2組間沒有差異。

2.3 免疫羊年齡對免疫效果的影響

從表3可以看出，6～10月齡的幼年羊與 28～42月齡的老年羊免疫產生抗體的水平接近，二免前、三免前和五免后抗體水平分別為1 ∶25、1 ∶26和1 ∶27左右，且組內差異較大，遠不如15～22月齡的成年羊，二免前、三免前和五免后15～22月齡成年羊的抗體水平分別接近1 ∶26、1 ∶27和1 ∶29。

3 結論與討論

3.1 不同免疫劑量對免疫效果的影響

3個免疫劑量以0.4 mg/(次·頭)免疫效果最好，免疫劑量過低[0.2 mg/(次·頭)]與過高[1.0 mg/(次·頭)]都不利于抗體的產生。通常情況下，免疫劑量太小時因刺激小不易產生免疫應答，產生抗體少，隨著劑量加大，抗體水平會不斷提高， 但劑量大到一定程度抗體就不再繼續增加。本試驗高劑量組出現了抗體水平反而降低的情況，是否是因為高劑量引起了“免疫耐受”或是“免疫抑制”還有待繼續研究。

表2 不同免疫途徑抗體效價比較

表3 不同年齡免疫羊抗體效價比較

3.2 不同免疫途徑對免疫效果的影響

3種免疫途徑中肌肉注射反應較差，皮下多點及皮內+淋巴2種途徑效果一致，但皮下注射操作相對比較方便。在半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(CYS-C)免疫試驗中發現，皮內+淋巴的免疫方法效果明顯好于皮下多點(筆者所在團隊做的同期試驗，尚未發表)，但本試驗未能有同樣效果，這可能是由于CYS-C分子量小，皮內+淋巴注射能增加刺激強度，而ApoB分子量較大，皮下注射已達到足夠的刺激強度。

3.3 免疫羊年齡對免疫效果的影響

15～22月齡的成年羊對ApoB抗原的反應強度明顯高于6～10月齡的幼年羊與28～42月齡的老年羊。出現這一結果的原因可能是幼年羊的免疫功能尚不健全，而老年羊的免疫功能開始退化；另外，幼年羊與老年羊組內差異較成年羊大，一方面說明幼年羊6～10月間免疫功能發育比較快，另一方面說明老年羊組內年齡差距太大，28月齡羊功能接近成年羊，而42月齡羊功能已大幅衰退。

綜上所述，本試驗通過不同免疫劑量、不同免疫途徑及不同羊年齡的比較，初步形成了一套以湖羊為對象的羊抗人ApoB高效價抗血清的免疫制備方法，效價接近1 ∶29。但影響免疫效果的因素很多，除了抗原自身性質及本研究的因素之外，抗原的注射劑量、注射次數、間隔時間及抗原佐劑等都會對抗體效價產生影響[6-9]，要真正形成最優方法還須要對其他因素及各因素間的互作進行研究與分析。