小麥錳超氧化物歧化酶基因的克隆與原核表達

于永昂， 張 蕾， 趙俊杰， 賀 杰， 馬振鋒， 胡海燕

(河南科技學院生命科技學院/現代生物育種河南省協同創新中心，河南新鄉 453003)

植物在自然界中經常會受到病菌、干旱、冷害和高鹽等生物和非生物脅迫，引發細胞內部產生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，大量積累的ROS能夠對植物體內的核酸、脂質、蛋白質等生物大分子產生傷害[1]。為了保持細胞內部氧化還原的平衡，植物在長期進化過程中發展出幾種酶和非酶系統來緩解由活性氧引起的氧化損傷，其中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是植物用來清除活性氧的一種關鍵酶。SOD能夠催化植物體內分子氧活化的中間產物超氧陰離子自由基(O2-·)的歧化反應從而生成氧分子和過氧化氫，在逆境脅迫下增強SOD基因表達能夠提高植物清除活性氧的能力，增強植物的抗逆性[2]。超氧化物歧化酶按照金屬輔基主要分為鐵(Fe)SOD、(錳)SOD和(銅/鋅)SOD 3種。許多研究表明，MnSOD與作物的抗逆性有著密切的關系。Tanaka等利用酵母MnSOD在水稻中過量表達提高了轉基因植株對鹽脅迫的耐受性，轉基因植株的SOD和抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)活性在鹽脅迫處理條件下能夠提高1.5～2.0倍[3]；韓利芳等將煙草MnSOD基因轉入苜蓿中提高了轉基因植株的MnSOD活性[4]；王丙鋒等將檉柳MnSOD基因轉化到酵母基因組中，提高了酵母的抗旱和耐高溫的能力[5]；陳莉等在仙客來中過表達MnSOD基因，提高了轉基因植物對高溫脅迫的抗性[6]。

小麥是我國重要的糧食作物之一，但干旱、低溫和鹽堿等非生物脅迫嚴重影響其產量[7]。為此，本研究從小麥葉片中克隆MnSOD基因全長序列，并對該基因蛋白在生物信息學分析的基礎上構建了pET32-TaMnSOD原核表達載體，在大腸桿菌中用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)成功誘導表達出目的蛋白，為小麥MnSOD蛋白的進一步分離純化和基因的表達、提高小麥對逆境脅迫的適應能力奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 本試驗小麥品種為矮抗58，由河南科技學院小麥中心提供。2016年5月選取顆粒飽滿、大小一致的種子用0.1% HgCl2消毒10 min后，用流水沖洗5次后置于鋪有濾紙的培養皿中發芽，3 d后選取發芽的小麥種子播種至含有混合營養基質的營養缽內，在16 h光照(28 ℃)—8 h黑暗(25 ℃)培養箱中培養，3葉期時，取新鮮嫩葉用液氮速凍后，-80 ℃冰箱保存備用。

1.1.2 菌株與試劑 原核表達載體pET-32a、大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α及表達菌株BL21(DE3)均由河南科技學院生命科技學院分子生物學實驗室保存。pGM-T載體、DNA凝膠回收試劑盒、TaqDNA聚合酶及質粒小量抽提試劑盒均購自TIANGEN公司；T4 DNA連接酶、限制性內切酶購自TaKaRa公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 小麥葉片總RNA的提取和cDNA的合成 參照Trizol試劑盒說明書提取小麥葉片的總RNA。調整提取的RNA濃度為200 ng/μL，用PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)(TaKaRa，大連)按操作說明合成cDNA第1鏈。

1.2.2 小麥MnSOD基因的克隆 根據GenBank公布的小麥MnSOD基因序列(GenBank登錄號：AF092524)設計特異性引物MnSOD-F1(5′-CCATGGCGCTCCGCACGTT-3′)和MnSOD-R1(5′-GTGTCACCTCTATGCAATGT-3′)。以cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應程序：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，33個循環；72 ℃延伸5 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化PCR產物。將回收的目的片段與pGM-T載體連接后轉化DH5α感受態細胞，挑取陽性克隆進行PCR鑒定后送北京三博遠志生物技術有限公司進行測序。

1.2.3 小麥MnSOD基因的生物信息學分析 用ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)分析小麥MnSOD編碼氨基酸序列的物理性質；用Predict protein預測MnSOD基因編碼蛋白的二級結構；用SMATER分析MnSOD基因編碼蛋白的氨基酸序列的保守結構域；利用BlastP(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)進行同源性搜索，選取與小麥MnSOD同源性較高的植物的MnSOD氨基酸序列，利用DNAMAN 8.0進行多序列比對，用Mega 5.0軟件構建系統發育樹。

1.2.4 原核表達載體的構建 根據獲得的小麥MnSOD編碼區序列設計原核表達引物MnSOD-F2(5′-CGGGATCCATGGCGCTCCGCACGTTG-3′，下劃線部分為BamHⅠ酶切位點)和MnSOD-R2(5′-CCCAAGCTTCGCAAGCACTTTTTC ATA-3′，下劃線部分為Hind Ⅲ酶切位點)，以小麥葉片cDNA為模板進行PCR擴增。用T4連接酶將回收純化的PCR產物與pGM-T載體于16 ℃連接過夜，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，挑取單克隆進行測序分析。將測序正確的pGM-TaMnSOD質粒與原核表達載體pET-32a分別用BamHⅠ和Hind Ⅲ進行雙酶切操作，回收目的片段，經T4連接酶連接后，轉化DH5α感受態細胞，抽提質粒經PCR和雙酶切鑒定，獲得原核表達載體pET32a-TaMnSOD。

1.2.5 重組質粒融合蛋白的表達 將測序正確的pET32a-TaMnSOD重組質粒熱激轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，涂布于含有卡那霉素的LB平板上。挑取陽性克隆于含有卡那霉素的5 mL LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min培養12 h。按1%的接種量接種到10 mL LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養至D600 nm為0.5左右，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導3 h。5 000 r/min離心5 min收集菌體，加入SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)上樣緩沖液煮沸10 min，取10 μL進行SDS-PAGE(5%濃縮膠，12%分離膠)，分析蛋白表達結果。

2 結果與分析

2.1 小麥MnSOD基因的克隆

以小麥葉片cDNA為模板進行逆轉錄PCR(RT-PCR)，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，在分子量相當于750 bp左右擴增出1條清晰的條帶(圖1)，與預測大小相符，推斷其為小麥MnSOD基因序列。測序結果表明，該基因全長813 bp。采用NCBI(美國國立生物技術信息中心)的ORF Finder分析發現，該序列包含1個675 bp的開放閱讀框，編碼224個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA(圖2)。

2.2 小麥MnSOD基因的生物信息學分析

用ProtParam預測TaMnSOD基因編碼蛋白的相對分子量為24.56 ku，分子式為C1 119H1 724N300O318S3，等電點(pI)為6.83。理論推導其半衰期約為30 h，不穩定參數為29.56，蛋白質性質穩定(不穩定參數在40以下為穩定蛋白)。總的帶負電荷的殘基(Asp+Glu，即天冬氨酸+谷氨酸)為24個，總的帶正電荷的殘基(Arg+Lys，即精氨酸+賴氨酸)為23個。親水性平均數為-0.269，預測該蛋白為親水性蛋白，其脂肪指數為91.52。用TMHMM-2.0(http：//www. cbs. dtu. dk / services / TMHMM-2.0)對TaMnSOD的氨基酸序列進行分析，沒有跨膜結構域，沒有信號肽，是一個可溶性蛋白質。MnSOD蛋白二級結構預測結果顯示，在整個蛋白中，α-螺旋占35.71%，β-折疊占15.18%，無規則卷曲占27.23%，延伸鏈占 21.88%。將推測的TaMnSOD氨基酸序列在GenBank上進行Blast比對后，采用DNAMAN 6.0軟件進行多重序列比對。將克隆的TaMnSOD基因編碼的氨基酸序列與GenBank中其他植物的MnSOD氨基酸序列進行比對，發現該基因編碼蛋白與大麥(BAK03227)、二穗短柄草(XP_010231530)、水稻(XP_015640127)的MnSOD具有較高的同源性，氨基酸相似性分別達到95.13%、88.70%、82.68%(圖3)。進一步經Clustal W聚類分析后，利用Mega 5.0軟件采用相鄰連接法繪制進化樹，結果表明，本研究克隆的小麥TaMnSOD基因編碼的蛋白和大麥的親緣關系最近(圖4)。

2.3 原核表達載體的構建與鑒定

使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切質粒pET32-TaMnSOD，切出來的片段與預期結果大小一致，表明TaMnSOD基因已經插入載體pET-32a中(圖5)。酶切鑒定正確的陽性克隆，經測序后顯示插入的外源基因序列與預期片段序列一致，未出現堿基突變及移碼現象。由此表明，pET32-TaMnSOD原核表達載體構建成功。

2.4 MnSOD基因重組蛋白的SDS-PAGE分析

將構建成功的重組表達質粒pET32-TaMnSOD轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，在37℃、IPTG濃度為0.5 mmol/L 條件下，分別誘導1、2、3、4 h后進行SDS-PAGE分析。圖6結果表明，與對照相比，pET32-TaMnSOD轉化菌經IPTG誘導后，在相對分子質量為45 ku左右處有1條蛋白條帶，除去載體PET32自身表達的20 ku蛋白后，結果與預期的目的蛋白(24.56 ku)大小一致。

3 討論

植物在不利環境脅迫(鹽漬、干旱、高溫、低溫等)下其細胞代謝過程不協調會引起ROS大量積累，構成氧化脅迫威脅植物的細胞結構[8-9]。因此，采用分子生物學手段，對植物的氧化代謝進行修飾，提高植物抗氧化脅迫的能力，是植物抗性研究的方向之一[10-11]。SOD是植物細胞防御系統中重要的保護酶類，在防御活性氧傷害中起著關鍵性的作用，其活性高低與植物的抗逆能力密切相關[12]。目前，植物中許多MnSOD基因已經被克隆并用來轉化不同植物，獲得了SOD活性增強的轉基因植株。鄧婷婷等將極端耐鹽的鹽生杜氏藻的DsMnSOD基因轉化SOD缺陷型大腸桿菌并誘導其表達，結果表明，轉染后的大腸桿菌在耐鹽和抗寒等方面的耐受性明顯提高[13]。付暢等將西伯利亞蓼PsMnSOD基因轉入酵母中，提高了酵母在鹽堿脅迫下的SOD活性，并提高了酵母對鹽堿脅迫的抗性，表明PsMnSOD基因在抵御鹽堿脅迫中起到非常重要的作用[14]。另外，MnSOD在轉基因煙草、苜蓿和棉花等植物中的過量表達提高了它們對氧化脅迫的耐受性[10]。由此表明，MnSOD基因對于增強植物的抗逆能力具有重要作用。

目前，用于表達重組蛋白的外源系統主要有大腸桿菌系統、酵母表達系統和動物細胞表達系統[15-17]。大腸桿菌表達系統因其具有遺傳背景清楚、結構簡單、外源蛋白表達量高以及基因表達調控機制明確等優點，已經成為目前最常用的表達宿主[18]。真核生物基因的原核表達受表達載體、宿主菌、IPTG濃度、溫度、誘導表達時間等因素的影響[19-20]。本試驗采用目前應用最廣泛的pET大腸桿菌表達系統進行原核表達，該系統能與Tag(標簽)連接進行融合蛋白表達，目的蛋白易于純化，并且具有操作方便、表達量大等優點[21]。一般 37 ℃、0.5 mmol/L 終濃度的IPTG適合絕大多數的蛋白表達，本研究采用該條件進行原核表達，所表達出的融合蛋白與目的蛋白相對分子量一致。

本研究從小麥葉片中克隆到Mn超氧化物歧化酶基因TaMnSOD，其編碼蛋白與其他植物中的MnSOD具有較高的相似性。將TaMnSOD基因與原核表達載體PET-32a構建融合表達載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達，從而為小麥MnSOD基因編碼蛋白功能研究提供理論基礎。