銀杏愈傷組織誘導及其雙黃酮含量的測定

王霞霞， 高 平， 李 棟， 郝旺林， 何 真

(1.呂梁學院生命科學系，山西呂梁 033000； 2.山西省農業科學院，山西太原 030006)

銀杏(GinkgobilobaL.)為銀杏科銀杏屬落葉喬木，別稱白果、公孫樹、鴨腳樹、蒲扇[1-3]，素有裸子植物“活化石”之稱，為中國獨存的珍稀名貴樹種[4-6]。銀杏及其愈傷組織中含有黃酮、雙黃酮等黃酮類化合物[7]，對心腦血管疾病具有獨特療效[8-9]，因此銀杏葉提取物及其制劑在國際市場上供不應求[3]。自然條件下，銀杏葉中黃酮含量也較高[10]。但銀杏栽培需要大量面積，生長周期長，且易受多種外界條件影響[11-12]。近年我國研究人員發現誘導的銀杏愈傷組織中也含有黃酮類物質，目前有利用銀杏愈傷組織的細胞懸浮培養來生產黃酮類次生代謝產物的研究[13-15]。從愈傷組織中提取黃酮類物質，能有效縮短生產周期，滿足工業化生產需要[1]，對黃酮類物質生產量提高和加工產業發展有重大意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

銀杏葉片、葉柄、樹皮等外植體均采自呂梁學院校園內銀杏樹。

1.2 試驗方法

采用L9(34)正交設計表選擇最適合外植體的消毒配比，外植體(A)選擇葉片、葉柄、樹皮。將10%次氯酸鈉消毒時間(B)設計為3個梯度3、6、9 min，將75%乙醇消毒時間(C)設計為3個梯度分別為40、50、60 s(表1)。

表1 外植體和消毒時間的正交設計因素和水平

采用L9(34)正交設計表選擇誘導銀杏愈傷組織最適宜激素種類和濃度配比，KT水平設置為0、0.2、0.4 mg/L，6-BA水平設置為0.5、1.0、1.5 mg/L，2，4-D水平設置為0、0.5、1.0 mg/L(表2)。

表2 誘導愈傷組織的正交設計因素和水平

采用L9(34)正交設計表選擇愈傷組織增殖最適宜激素濃度配比，KT水平設置為1.0、1.5、2.0 mg/L，6-BA水平設置為0.5、1.0、1.5 mg/L，2，4-D水平設置為0.0、1.0、2.0 mg/L，NAA水平設置為0.5、1.0、1.5 mg/L(表3)。

表3 愈傷組織增殖的正交設計因素和水平

1.3 雙黃酮提取

應用十字交叉法隨機取樣愈傷組織，放置在60 ℃電熱鼓風干燥箱中烘干至恒質量；把烘干的愈傷組織置于研磨器中研磨成粉末，在冷凍箱中冷凍保存備用。

用醇提法[16]提取愈傷組織中的雙黃酮；以蕓香苷為標準品制作標準曲線[17-18]，采用高效液相色譜儀[19-20]測量雙黃酮的含量。

1.4 計算及數據處理

存活率=存活的外植體數/接種的外植體數×100%；

愈傷組織誘導率=誘導產生愈傷組織的個體數/存活個體數×100%；

愈傷組織增殖倍數=(培養30 d后裝有愈傷組織培養皿質量-取出愈傷組織培養皿質量)/(接種愈傷組織后培養皿質量-接種前裝有培養基的培養皿質量)。

數據用SPSS軟件處理。

蕓香苷標準曲線方程為：y=0.062 4x+13.943 6；雙黃酮得率依據梁文惠等的方法[18]計算。

2 結果與分析

2.1 不同消毒劑消毒時間對不同外植體成活率的影響

由表4可知，葉片作為外植體成活率明顯高于葉柄和樹皮。10% NaClO消毒時間6 min成活率明顯高于3 min和 9 min，說明10% NaClO消毒時間過長和過短都不利于外植體的成活。75%乙醇消毒時間為40 s成活率高于50 s和 60 s，說明乙醇消毒時間不宜過長。又經極差分析可知，外植體、10% NaClO、75%乙醇的成活率極差分別為13.36、26.75、9.30百分點，因此，影響外植體成活的主次關系為：10% NaClO>外植體>75%乙醇。由此可得到最優水平組合為A1B2C1，即外植體為葉片、10% NaClO消毒時間為6 min，75%乙醇消毒時間為40 s。

表4 不同消毒時間外植體成活率L9(34)正交試驗結果

將上述最優消毒條件組合進行一次驗證試驗，得到外植體成活率為84.21%，高于表4中所有9組試驗的成活率，故確定最優試驗組合為A1B2C1。

2.2 不同激素濃度對愈傷誘導的影響

由表5可知，0.2 mg/L的KT誘導率均高于不加KT和0.4 mg/L KT，說明KT濃度過低和過高都不利于誘導愈傷組織。1.0 mg/L 6-BA誘導率高于0.5 mg/L 6-BA和 1.5 mg/L 6-BA，說明適宜的6-BA濃度有利于誘導愈傷組織。1.0 mg/L 2，4-D誘導率高于0.5 mg/L，說明要誘導愈傷組織2，4-D濃度不能過低。經極差分析可知，KT、6-BA、2，4-D的誘導率極差為11.11、8.89、15.55百分點，因此，影響愈傷組織誘導的主次關系為：2，4-D>KT>6-BA。由此可得到最優水平組合為D2E2F3，即0.4 mg/L KT、1.0 mg/L 6-BA、1.0 mg/L 2，4-D。

表5 不同激素濃度對愈傷誘導率L9(34)正交試驗結果

設計的9組試驗中5號試驗與理論最優組合吻合，故不用再做對比試驗，最優組合為5號試驗，即D2E2F3。

2.3 不同激素濃度對愈傷組織增殖的影響

由表6可知，1.5 mg/L KT的增殖倍數均高于1.0 mg/L KT和2.0 mg/L KT，說明KT濃度過低和過高都不利于愈傷組織增殖。1.0 mg/L 6-BA增殖倍數高于0.5 mg/L 6-BA和1.5 mg/L 6-BA，說明適宜的6-BA濃度有利于愈傷組織增殖。2.0 mg/L 2，4-D增殖倍數高于不加和加1.0 mg/L 2，4-D，說明愈傷組織增殖的2,4-D濃度不能過低。1.5 mg/L NAA增殖倍數高于0.5 mg/L和1.5 mg/L NAA，說明愈傷組織增殖NAA濃度也不能過低。經極差分析可知，KT、6-BA、2，4-D、NAA的增殖倍數極差為1.08、0.18、0.28、0.17，因此，影響愈傷組織誘導的主次關系為：KT>2，4-D>6-BA>NAA。由此可得到最優水平組合為G2H2I3J3，即：1.5 mg/L KT、1.0 mg/L 6-BA、2.0 mg/L 2，4-D、1.5 mg/L NAA。驗證試驗結果表明：該組合條件下的愈傷組織增殖倍數為2.92，高于設計的9組試驗的增殖倍數，可以確定該組合為最優條件。

2.4 愈傷組織中雙黃酮的含量

試驗結果表明，愈傷組織中雙黃酮在波長260 nm處有最大吸收峰，與雙黃酮標準樣品的吸收峰波長在60 min出峰，峰形尖銳而且沒有雜峰。樣品在相應的時間段內也出峰，與標準樣品出峰時間基本吻合。由標準曲線、峰面積，對標樣濃度計算相關系數為0.9962，相關性好。參照蕓香苷標準曲線算得的雙黃酮得率為15.62 mg/g。

表6 不同激素對愈傷組織增殖L9(34)正交試驗結果

3 討論與結論

由于主客觀條件的局限性，對成活的外植體沒有進行脫毒檢測，再后期的繼代增殖中容易爆發大范圍的感染。對于外植體消毒試驗應該對試驗過程產生的各種微生物進行分離純化，鑒定微生物的種類和分析微生物產生的原因。

在正交試驗中2，4-D的濃度沒有篩選出最佳濃度，在后期的試驗中應對其設置多個濃度梯度進行單因素試驗，篩選出2，4-D的濃度對誘導愈傷組織的最佳濃度，這樣試驗才更具完整性和精確性。

愈傷組織雙黃酮的得率比自然條件下葉片的得率高，但與鄧祥宜等的得率[21]有差別?？赡芘c愈傷組織的生長增殖的速率和繼代次數有關，也可能與雙黃酮的提取條件有關。在后續的試驗中應進一步研究不同時期的愈傷組織和增殖代數對雙黃酮含量的影響和提取條件的優化。

用銀杏愈傷組織提取雙黃酮的提取率比較高[21]，而且比用銀杏葉提取雙黃酮提取率要高得多[22]。這樣可以打破季節的束縛，也可以提高雙黃酮的獲得量，可以很好地滿足市場需求。