興化龍香芋脫毒快繁組培技術體系的建立與優化

王 立， 殷劍美， 張培通， 韓曉勇， 郭文琦， 李春宏

(江蘇省農業科學院經濟作物研究所，江蘇南京 210014)

興化龍香芋是江蘇省泰州市興化地區特有的芋頭品種，其母芋近圓形，肉質白、粉而香，子芋少，呈橢圓形，肉質粉且糯[1]。興化龍香芋采用垛田種植，生長方式獨特，種植歷史悠久，耐貯運，品質優良，含有豐富的蛋白質、淀粉以及鈣、鐵等礦物質，是人們喜食的蔬菜品種之一。隨著紀錄片《舌尖上的中國》的熱播，興化的垛田龍香芋成功申請了國家地理標志保護，其品牌價值迅速提升，市場需求量巨大。但是，由于生產上常采用塊莖繁殖龍香芋，長期的自繁留種易引起興化龍香芋的種性退化，導致芋病毒病的普遍發生，從而嚴重影響興化龍香芋的產量和品質[2]。目前，采用組織培養技術對芋組織進行脫毒快繁的研究已有報道，通過組織培養脫毒技術不但可以降低芋植株的發病率，還能明顯提高芋頭的產量和品質[3-5]。

正交試驗不僅可以大大減少工作量，還可以通過分析極差和方差結果，發現組培過程中的關鍵因素，獲得最佳培養條件和培養基最優組合，因此在植物組織培養中具有重要的應用價值[6]。本研究通過對興化龍香芋莖尖組培技術進行研究，旨在建立并優化興化龍香芋莖尖脫毒快速繁殖組織培養技術體系，探索興化龍香芋農家優良品種脫毒復壯的有效方法，為優良龍香芋種源的生產提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇大小一致、外表無創傷的興化龍香芋球莖，用0.5% K2MnO4浸泡5 min后，用沙土覆蓋至整個芋塊的2/3處，放置于光照培養箱中，在溫度為25 ℃、相對濕度為70%的條件下催芽10 d左右。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的選取及消毒滅菌 待球莖頂芽生長到3～4 cm 長時，剝除外層2～3層鱗片，切下頂芽，切成帶球莖 1 cm3左右的芽，用流動的水沖洗10 min。在無菌條件下進行以下操作：用70%乙醇表面消毒2次，每次30 s，然后放在5%次氯酸鈉溶液中消毒10 min，最后用無菌水清洗3～4次，獲得無菌外植體；使用體視顯微鏡和解剖針將頂芽外層的鱗芽剝除，獲得長1.0 mm左右的莖尖生長點。

1.2.2 愈傷組織的誘導 在無菌條件下，對上述所得的無菌外植體進行不定芽的誘導。培養條件：白天溫度為(25±1) ℃，夜間溫度為(20±1) ℃，濕度為65%～70%，光照度為3 000 lx，光照時間為12 h/d。誘導培養基以MS+30 g/L蔗糖+6.0 g/L瓊脂為基本培養基(pH值為5.8)，按照表1的配方分別添加0.1、0.5、1.0 mg/L TDZ(噻苯隆)，0.1、0.5、1.0 mg/L 2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)和0.1、0.2、0.3 mg/L 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)。培養40 d后，統計愈傷組織誘導情況。愈傷組織誘導率=誘導出愈傷組織的外植體數/接種的外植體總數×100%。每個處理設15個外植體，重復3次，計算平均值。

表1 愈傷組織誘導的L9(33)正交試驗設計

1.2.3 不定芽誘導 在無菌條件下，對誘導獲得的愈傷組織進行不定芽的誘導。誘導培養基以MS+30 g/L蔗糖+6.0 g/L 瓊脂為基本培養基，附加0.1、0.5、1.0 mg/L TDZ，0.1、0.5、1.0 mg/L 2，4-D和0.1、0.2、0.3mg/L 6-BA(表1)。培養45 d后，觀察并統計外植體的不定芽誘導情況。不定芽誘導率=誘導出不定芽的外植體數/接種外植體總數×100%。每個處理設15個愈傷，重復3次，計算平均值。

1.2.4 不定芽的分化和增殖 將誘導出的不定芽接入以MS+30 g/L蔗糖+6.0 g/L瓊脂為基本培養基，同時附加表1中按L9(33)正交試驗設計的培養基配方，誘導不定芽分化和增殖。培養30 d后，觀察并統計不定芽增殖情況。不定芽分化率=(長出不定芽的外植體數/外植體總數)×100%；增殖系數=增殖后不定芽總數/接種的不定芽總數。每個處理設20個不定芽，重復3 次，計算平均值。

1.2.5 組培苗生根 將增殖培養所得的1～3 cm高的組培苗切割，接種在以1/2MS+30 g/L蔗糖+6.0 g/L瓊脂為基本培養基，同時附加表2按L9(33)正交試驗設計的培養基配方，誘導不定芽生根，培養30 d后，觀察并統計不定芽的生根情況。生根率=生根外植體數/接種外植體數×100%。每個處理接種10個外植體，重復3次，計算平均值。

表2 組培苗生根誘導的L9(33)正交試驗設計

1.3 數據統計與處理

采用Excel 2016、SPSS 17.0對試驗數據進行方差分析，采用Duncan’s法進行差異顯著性檢驗。結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 不同激素水平組合對興化龍香芋愈傷組織誘導的影響

將外植體接種在誘導培養基內10～15 d后，開始形成愈傷組織，莖尖開始膨大。由圖1可以看出，30 d左右出現淡黃色團狀的愈傷組織；40～55 d左右產生大量疏松的淡黃色顆粒狀愈傷組織；60～70 d后愈傷組織顆粒變成綠色，并開始分化形成不定芽；80～90 d左右可以進行不定芽增殖誘導。

表3結果顯示，隨著TDZ和2，4-D濃度的增加，形成愈傷組織的興化龍香芋外植體數量不斷增加，愈傷組織誘導率不斷提高。從誘導外植體數量和愈傷組織誘導率來看，2，4-D的極差均為最大值，表明2，4-D對興化龍香芋愈傷組織誘導的影響最大，其次是6-BA、TDZ。結合表4的方差分析結果可知，興化龍香芋愈傷組織誘導的最佳激素組合是 0.5 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L 6-BA，在此濃度組合下，誘導外植體數量、愈傷組織誘導率均為最大值，分別為13.67個、91.11%。

2.2 不同激素水平組合對興化龍香芋不定芽誘導的影響

將不定芽從愈傷組織上切下，轉入不定芽誘導培養基中培養。由表5不定芽誘導率來看，TDZ的R值最大，其次是2，4-D和6-BA，這表明TDZ對興化龍香芋不定芽誘導的影響最大。當TDZ的激素水平從0.1 mg/L增加到0.5 mg/L時，興化龍香芋的不定芽誘導率極顯著提高(從TDZ濃度為0.1 mg/L時最高的44.44%提高到TDZ濃度為0.5 mg/L時最高的88.89%)；而6-BA對不定芽誘導的增強效果不明顯：當TDZ濃度較低(低于0.5 mg/L)時，增加6-BA濃度可以促進不定芽分化；而當TDZ濃度提高后，增加6-BA濃度反而會抑制不定芽的誘導。方差分析結果顯示，TDZ的F值最大，與2，4-D、6-BA相比差異極顯著(表6)，表明TDZ的濃度是決定興化龍香芋不定芽誘導的最重要因素，此結論與極差分析所得結論一致。由表5及以上分析可知，興化龍香芋不定芽誘導的激素最佳組合是0.5 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L 6-BA，此時不定芽誘導率最高，為 88.89%。

表3 不同水平組合對興化龍香芋愈傷組織誘導的影響

注：同列數據后標有不同大寫、小寫字母分別表示差異極顯著(P<0.01)、顯著(P<0.05)。表5、表7、表9同。

表4 興化龍香芋愈傷組織誘導率的方差分析結果

注：愈傷組織誘導率的R2=0.976(校正R2=0.902)?！?”表示差異顯著(P<0.05)。

表5 不同水平組合對興化龍香芋不定芽誘導的影響

表6 興化龍香芋愈傷不定芽誘導的方差分析結果

注：R誘導率2=0.999(校正R2=0.997)?！?”“**”分別表示差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。

2.3 不同激素水平組合對興化龍香芋不定芽分化的影響

由表7中的R值可以看出，3種激素對不定芽分化產生的效應大小依次是TDZ>2，4-D>6-BA。由表8的方差分析結果可知，各水平的TDZ對不定芽分化率和增殖系數均有顯著影響。綜合分析可以確定，本試驗條件下不定芽分化的最佳激素組合為1.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L 6-BA。

表7 不同水平組合對興化龍香芋不定芽分化的影響

表8 興化龍香芋愈傷不定芽誘導方差分析結果

注：R分化率2=0.986(校正R2=0.944)，R增殖系數2=0.961(校正R2=0.845)。“*”表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 不同激素水平組合對興化龍香芋組培苗生根誘導的影響

興化龍香芋組培苗接種在生根培養基內10 d左右時，開始長出白色根毛；15～20 d時根毛向四周生長，并形成粗壯根系；30 d左右時生根數達到3～5條，根長為2～6 cm；40 d后可以煉苗；經過3～5 d的煉苗，將幼苗移栽到營養土基質中，30 d后移栽成活率達到100%。生根過程詳見圖2。

由表9可以看出，NAA、6-BA和活性炭3個因素對不定芽誘導生根的效應排序是NAA>活性炭>6-BA。由表9、表10可以看出，NAA對不定芽生根具有顯著影響，其次是6-BA 和活性炭，此結論與極差分析所得結論一致。綜合分析可知，興化龍香芋不定芽誘導生根的最佳培養基為 1/2MS+0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L活性炭+30 g/L蔗糖。

表9 不同水平組合對興化龍香芋組培苗生根的影響

表10 興化龍香芋愈傷不定芽誘導方差分析結果

注：R生根率2=0.984(校正R2=0.937)，R平均生根數2=0.971(校正R2=0.883)，R平均根長2=0.961(校正R2=0.846)?！?”表示差異顯著(P<0.05)。

3 討論

由于芋類植物長期的無性繁殖，使病毒在其植株中不斷積累、擴散，導致病毒病害逐年加重，造成芋頭產量和品質下降，出現嚴重的品種退化[7]。目前，在生產上危害較大的病毒病主要有芋花葉病毒病、黃瓜花葉病毒病、芋桿狀病毒病等[2]。但是，目前在生產中還沒有一種能夠完全免疫病毒病的芋品種，因此，對興化龍香芋開展莖尖脫毒快繁技術的研究十分必要。通過植物莖尖培養是目前獲得無病毒材料最有效的手段[8]，目前，莖尖培養脫病毒技術已經在以營養繁殖為主的植物中得到了廣泛應用，并在馬鈴薯、甘薯、大蒜、香蕉等作物上取得了明顯的增產效果[9-15]。

關于芋組織培養和快速繁殖技術的研究報道很多，但是對于不同的芋品種，相應的培養基組分和激素配方存在差異。柏新富等研究了萊陽孤芋的莖尖分生組織離體培養技術，最終獲得試管苗增殖培養基為MS+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA，試管苗生根培養基為MS+0.05 mg/L NAA+0.15 mg/L 6-BA[16]。詹忠根等對奉化大芋艿的莖尖脫毒苗進行研究，發現采用MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培養基的不定芽誘導率為75%，在培養基中添加芋頭汁、椰子汁等有機物可以實現不定芽繼代繁殖和誘導生根一步完成[17]。劉獨臣等對四川芋品種烏桿槍的莖尖離體培養進行研究，得到適宜的莖尖不定芽誘導培養基為MS+1.0 mg/L TDZ+0.2 mg/L NAA，適宜的生根培養基為MS+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA[18]。韓曉勇等對靖江香沙芋進行組織培養快繁技術研究，結果獲得適宜的芽誘導培養基為MS+0.5 mg/L TDZ，最適的繼代增殖培養基為MS+1.0 mg/L TDZ，最適生根培養基為1/2MS+0.1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.02%活性炭[19]。以上結果說明，對于不同來源和基因型的芋植物組織培養，其增殖分化生根等過程所需要的激素種類和濃度不盡相同，因此對于不同的芋品種開展組織培養，需要對培養基組分和培養條件進行比較和探索，以建立相應的組織培養技術體系。

本研究采用正交設計方式，研究了激素的種類、濃度及其配比對興化龍香芋組織培養的影響，與傳統單因素試驗相比，正交試驗能容納更多的因素和水平，最大限度地減少試驗誤差，從而提高試驗結果的準確率。本研究結果表明，2，4-D對興化龍香芋愈傷組織誘導的影響最大，適宜的愈傷組織誘導培養基為MS+0.5 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L 6-BA+30.0 g/L蔗糖；在不定芽誘導和增殖過程中，3種激素對興化龍香芋不定芽誘導率和增殖系數的影響大小依次是TDZ > 2，4-D > 6-BA，不定芽誘導和增殖的適宜培養基分別為MS+0.5 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L 6-BA+30.0 g/L蔗糖和MS+1.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L 6-BA+30.0 g/L蔗糖；適宜的生根培養基為1/2 MS+0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L活性炭+30.0 g/L蔗糖。