基于發現系統的植物胚挽救研究熱點分析

王杏利， 石汶汶， 鞠建偉， 許忠民

(1.西北農林科技大學圖書館，陜西楊凌 712100； 2.西北農林科技大學園藝學院，陜西楊凌 712100)

植物胚是一個具有全能性的多細胞結構，通常有2種來源，一種是有性的合子胚，另一種是無性的不定胚或體細胞胚。由不同倍性間雜交或遠緣雜交獲得的合子胚，在胚發育的初期階段就會退化或敗育，從而降低了育種效率[1-2]。胚挽救(embryo rescue)技術，是在適宜條件下對植物胚進行離體培養，使即將退化或敗育的胚繼續發育而形成再生植株，是作物育種的一項重要技術，利用該技術可以有效加快育種進程，對于農業生產具有重要意義。

在信息大爆炸的時代，隨著網絡資源的不斷發展、搜索平臺的不斷完善，面對唾手可得的文獻資源，如何快速聚焦研究熱點，確立自己的研究方向，成為科研工作者面對的新問題。為了幫助作物育種工作者了解植物胚挽救的研究熱點，本文以超星發現系統為數據統計源，通過數據分析與文本聚類等文獻分析方法對該主題進行深入研究。

1 材料與方法

超星發現系統是超星公司開發出來的一種文獻檢索系統，該系統是建立在海量元數據的基礎上，通過知識挖掘、數據倉儲、數據分析、資源整合、文獻計量學等相關方法與技術，在一個文獻檢索平臺上集成整合國內各種主要中文數據庫資源，其文獻類型包含專利、標準、中文期刊、學位論文、圖書、會議論文、科技成果、視頻等[3]。通過發現系統的分面聚類、知識關聯等可以聚焦研究主題的時序發展軌跡、研究熱點、核心研究機構或研究團隊，從而為相關研究人員快速了解該領域的研究前沿和熱點、確立自己的研究方向與學術交流提供信息參考。

本文以超星發現系統為檢索平臺，以主題詞=胚挽救為檢索式進行檢索，檢索截止日期為2018年4月5日。

2 結果與分析

2.1 文獻計量分析

文獻計量分析(bibliometric analysis)是情報研究的主要方法之一。科技文獻是科研成果的主要表現形式，其數量反映科學研究的活躍程度及科研工作者對某一主題的關注度，對科技文獻進行計量分析，可以使研究者快速明了相關主題的研究發展歷史、聚焦研究方向。

2.1.1 文獻類型及年份分布 依據上述檢索策略，共檢出文獻597篇，其中期刊論文272篇，學位論文150篇，會議論文46篇，專利45項，科技成果81項，其他文獻3篇。從文獻出版年份統計分析可見，關于胚挽救技術的研究起步于20世紀80年代，進入21世紀，隨著我國經濟的發展和科研條件的不斷改善，胚挽救研究在植物育種界得到了更廣泛的關注。在2000—2009年的10年間，有221篇論文；在2010—2017年，相關文獻量已有271篇。

2.1.2 核心研究機構及地區 文獻是科研成果的載體，文獻數量與質量是研究機構科研能力的直接體現。通過對檢出文獻的研究機構進行統計分析可見，有關胚挽救的研究主要集中在西北農林科技大學、河北農業大學、華中農業大學等高校及中國農業科學院、云南省農業科學院等科研院所。省域分布主要為陜西省，占總文獻量的31%，其次為湖北省、河北省。文獻量較多的前10個省(市)及其占比見圖1。

2.1.3 核心關鍵詞 關鍵詞是論文主題的直接體現，通過關鍵詞聚類，特別是可視化后的聚類結果，可以直觀快速地了解主題的研究熱點及相關性。對檢出的597篇文獻采用可視化分析，圖2中的球體大小代表關鍵詞出現頻率，顏色深淺代表關鍵詞與胚挽救的相關度。從圖2可以看出，胚挽救研究以葡萄、百合、胚培養、遠緣雜交、多倍體、組織培養等為主。

2.2 胚挽救研究的熱點分析

2.2.1 早期退化或發育不良胚的挽救 胚挽救技術開始于20世紀初，近年來，有關離體胚挽救技術體系研究的方法有3種類型，第1種是離體培養，第2種是活體轉移，第3種是活體培養。其中，尤以胚發育初期進行離體培養的研究最多，在通常情況下，遠緣雜交和不同倍性雜交形成的合子胚都可以通過胚挽救形成再生幼苗。胚齡、培養基的成分、培養基中的激素配比等3種因素與離體培養再生幼苗獲得的比例有關。利用離體胚挽救技術進行早期退化或發育不良胚的挽救，在桃育種中培育優質早熟桃品種的效果很好，并取得了成功。萬春雁等為探索胚退化機制及早熟桃的胚挽救育種方法，以早熟桃品種華光為試驗材料，以曙光為對照，從幼果期至后熟期觀測種胚的形態指標和內源激素水平變化，結果表明，華光和曙光的種胚縱、橫徑、質量與胚性指數都與果實發育呈正相關，華光品種的上述指標在開花后65 d達到最大值后就迅速下降，但同時出現胚退化現象，而曙光的上述指標仍呈小幅上升的趨勢[4]。郭印山等針對早熟葡萄育種中胚發育不全的問題而進行的早熟葡萄胚搶救技術研究表明，影響各個組合早熟葡萄雜交后代成苗率最重要的因素是取胚時期[5-7]。

2.2.2 克服遠緣雜交不親和 植物多倍體育種和遠緣雜交過程中常會出現胚敗育現象，造成胚敗育的有多種因素，如幼胚起源、胚乳與胚囊發育異常、激素與營養供應失調、基因調控和酶失活等。由于遠緣雜交的合子胚和胚乳發育不協調，結果將會導致雜種胚退化或者敗育，因此，胚挽救要在雜種胚退化或敗育前進行離體培養，這是進行遠緣雜交獲得新種質一種重要途徑[8-9]。選育植物新品種時，遠緣雜交技術通常是將野生種和野生近緣種的優良基因，通過雜交技術整合到優質栽培品種中，或者將不同種屬優良基因通過雜交重組選育出優質多抗植物新品種，然而遠緣雜交通常不親和，而利用胚挽救技術則可克服這種現象。孫亮等以富士蘋果為母本、金二十世紀梨和京白梨為父本進行屬間雜交試驗，以未授粉正常管理的果實為對照對授粉果實進行生物學觀察，并對幼胚進行挽救培養。結果發現，以金二十世紀梨為父本的雜交果坐果率為4.83%，以京白梨為父本的未坐果；雜交果實前期發育快，果實大于對照，后期發育慢，果實小于對照；果形指數前期小于對照，后期大于對照[10]。2009年扈新民等以甘藍顯性雄性不育系作母本，以蘿卜自交系作父本進行授粉雜交，對胚珠、子房進行離體培養，結果表明，胚珠培養的效果較子房培養好，子房培養僅獲得3株雜交苗，胚珠培養各處理共獲得29株雜交苗[11]。趙艷艷等為將油菜中根腫病抗性基因CRR導入甘藍從而獲得抗根腫病的結球甘藍材料，以二倍體結球甘藍與四倍體人工合成油菜為親本進行正反雜交，采用MS和B5培養基對雜交子房和胚珠進行胚挽救試驗，研究不同取樣時期、培養基、基因型及暗處理對胚珠萌發率的影響，并采用流式細胞儀法對雜交后代幼苗倍性進行初步鑒定，結果表明，胚珠培養優于子房培養，以油菜為母本進行雜交，獲得57株雜種苗，反交組合只得到7株[12]。張朝君等為獲得OTO(黃天霸×西伯利亞)遠緣雜交新材料，用東方百合品種西伯利亞與OT型百合黃天霸品種作為試驗材料，通過離體受精技術和不同授粉方式，利用胚挽救進行離體培養，試驗結果表明，通過非常規授粉方法進行授粉，子房膨大率較高；用常規方法授粉約15～20 d花瓣隨即枯萎，子房沒有膨大現象[13]。通過子房切斷的方法，黃天霸×西伯利亞子房的膨大率可以達到50%；采用柱頭嫁接的方法，西伯利亞×黃天霸子房的膨大率只有14%。在正反交試驗中，西伯利亞×黃天霸的雜交效果沒有黃天霸×西伯利亞的好，后者成功得到遠緣雜交材料。

2.2.3 植物新品種的選育 利用離體胚挽救技術體系選育植物新品種，在無籽葡萄育種方面取得了較大進展。無籽葡萄品種一般不能作為雜交母本，用有籽葡萄品種作為雜交母本，在后代中幾乎很難得到無籽類型品系。離體胚挽救可以使用葡萄假單性結實的無籽品種作為母本進行雜交成為可能[14-17]。陳昌文等通過胚挽救的方法獲得了蟠桃品種中蟠桃10號[18]。殷富有等經胚挽救成苗，進行回交、自交后育出云資粳41號[8]。此后，植物細胞工程技術在農作物品種改良和培育中得到廣泛應用。孫寧等應用細胞培養技術與常規育種方法進行水稻種質創新選育的研究，利用花粉培養建立了水稻的堊白性狀近等基因系，并成功選育出津稻294水稻新品系；通過胚挽救技術進行水稻雜交種及突變系的離體胚培養，成功獲得了野生水稻與栽培稻雜交后代的永久營養體[19]。在花卉方面，胚挽救也有應用，崔光芬等研究得出，金門百合是以OT百合T11作為雜交母本、以D74作為雜交父本，通過切割柱頭進行人工授粉，并結合離體胚挽救獲得的一種OT百合雜種系切花新品種[20]。顏津寧等選育出的迎春1號是利用切割柱頭雜交授粉、胚挽救、組培擴繁和種球復壯等技術，在開花后選取優良株系而獲得的百合切花新品種，該品種植株健壯、花大色艷、香味濃郁、商品性好、抗病能力強[21]。

2.2.4 利用胚挽救技術選育三倍體 三倍體和多倍體植物具有高度不育性，不能形成正常種子，二倍體和四倍體植株雜交后，利用胚挽救進行離體培養可以獲得部分三倍體植株。在植物育種方面，柑橘和葡萄的應用較多，由于這2種果樹的三倍體果實具有果大、無籽等優良特性，對葡萄二倍體和四倍體進行雜交，在幼胚敗育前對雜交種胚珠進行離體胚挽救，利用這種胚挽救技術已經獲得大量三倍體葡萄植株。石艷等為選育三倍體無核葡萄新品種，以二倍體歐洲葡萄無核品種愛莫無核、紅寶石無核、黎明無核與歐山雜種北醇以及四倍體歐美雜種藤稔、黑奧林為親本，進行了5個組合的雜交，通過胚挽救技術獲得雜種幼苗41株，并利用染色體計數法與流式細胞儀等方法對所獲得的再生植株進行倍性鑒定，結果表明，有10株雜種為三倍體，6株為四倍體，4株為非整倍體，其余21株為二倍體[22]。2014年，郭印山等以二倍體葡萄品種和四倍體葡萄品種為親本進行正反雜交試驗，對雜交胚珠進行胚挽救，利用染色體計數法和流式細胞儀等對雜交后代幼苗倍性進行了鑒定，結果表明，無核紅寶石×香悅于開花后60 d接種胚珠萌發率最高，為8.33%，得到雜種再生植株8株，其中有1株為三倍體植株(12.5%)；香悅×無核紅寶石在花后83 d接種胚珠萌發率最高，為29.38%，獲得雜種再生幼苗56株，其中有16株為三倍體幼苗(27.59%)[23]。由于柑橘三倍體植株具有果大、無籽、抗病性強等特性，因而育種者都把三倍體作為一個重要育種目標。雖然獲得柑橘三倍體植株的途徑很多，但是二倍體和四倍體雜交具有一定的優勢，該方法可以在短時間內有效地聚合二者的優良性狀，所以是柑橘三倍體育種的一種最重要的途徑。高清華等提到，1957年，Ohta等首次對柑橘胚進行離體培養，并獲得成功，研究結果表明，以多胚性柑橘品種作母本可獲得成熟種子，但其實生后代中的雜種苗比例均較低[1]。劉可慧等以3個柑橘異源四倍體體細胞雜種為父本，分別與二倍體單胚性沙田柚進行屬間雜交，在胚敗育前，利用胚搶救技術進行離體培養，利用流式細胞分析儀進行檢測，結果表明，獲得的再生植株為柑橘三倍體植株[24]。

2.2.5 胚挽救在分子標記方面的應用 近幾年來，隨著分子標記技術的快速發展，進一步挖掘野生植物有益基因已經日益成為現代植物育種的一條重要途徑[25]。余文貴等采用構建野生番茄漸滲系途徑，不但加快了有用性狀篩選，而且可以縮短育種時間，進一步促進了數量性狀遺傳的基礎研究[26]。2005年郭海江等報道，以歐洲無核葡萄品種作母本、以歐洲普通葡萄品種和中國野生葡萄品種為父本雜交了16個組合，利用離體胚挽救獲得再生植株55個[27]。劉仕琴等將長雄野生稻和泰國秈稻RD23雜交，利用離體胚挽救獲得再生植株F1代，隨后利用泰國秈稻RD23作為輪回親本和F1代連續回交得到BC6群體，并對紅米基因進行分子定位研究，為紅米的遺傳基因定位研究奠定了基礎[28]。周國治等通過胚挽救技術獲得番茄抗根結線蟲雜種[29]。趙鶴等通過幼胚挽救培養獲得秘魯番茄LA3858植株[30]。

2.3 胚挽救技術成功應用于植物育種實踐的影響因素

2.3.1 培養時期 朱際君等認為，胚的發育階段不同，其培養成功的概率也是不同的，胚齡越小，培養成功率越低[31-32]。在胚發育早期，合子胚其實完全處于異養狀態，其發育所需條件和營養要求比較復雜，離體培養很難成功。可是在胚發育后期，又會因為母體內發育不協調從而導致幼胚退化或敗育。因而離體培養最好選擇幼胚發育程度較高，而且生活力最強時期。董曉玲等利用胚挽救技術對葡萄無核品種楊格爾的研究發現，在開花后27～33 d間進行胚離體培養的成功率較高[15]。李桂榮等以金光杏梅胚為材料的研究結果表明，金光杏梅在落花后49 d左右進行離體培養效果最佳，在此時期胚乳開始退化，幼胚剛出現畸形，核也開始出現木質化，果實體積達到總體積的77.9%[33]。顧愛俠等研究認為，大白菜和甘藍進行種間雜交，授粉后5～7 d進行子房離體培養的效果最好[34]。

2.3.2 培養條件和培養基 離體胚挽救成功的關鍵是適宜的培養基。研究表明，植物幼胚的發育時期與物種不同，胚挽救需要的培養基也不盡相同。影響離體培養的環境因子很多，如溫度、pH值與光照度。植物胚在不同發育時期需要不同的pH值。Kantharajah等用MS與MT為基本培養基進行獼猴桃和柑橘離體培養，取得了較好的效果[35]。Carimi等研究表明，在柑橘胚挽救培養時，在培養基中添加麥芽提取物可以提高成苗率[36]。李玉玲等對葡萄雜交胚珠進行胚挽救的研究表明，在花前2周噴施5 mg/L 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)可以提高火洲黑玉的成苗率；在繼代培養基中加入CCC(氯化氯代膽堿)可以壯苗，提高移栽成活率[37]。趙凱等以敗育型無核葡萄為母本、以歐山雜種作父本進行人工雜交，對雜交胚珠進行離體培養，結果表明，在3種胚珠培養基中，以ER(一種培養基)+500 mg/L水解絡蛋白(CH)+0.5 mg/L GA3(赤霉素)+1.5 mg/L IAA(吲哚-3-乙酸)培養基的胚發育率和成苗率最高，其結果也表明，CH和GA3、IAA的添加對胚發育率和成苗率均沒有顯著影響[38]。

2.3.3 激素水平 生長調節劑在胚挽救中也起著至關重要的作用，幼胚正常生長需要較低濃度的細胞分裂素，而高濃度細胞分裂素會抑制胚生長，甚至會促進胚形成非器官性愈傷組織，胚離體培養過程中細胞分裂素和生長素分別起到促進胚嫩芽分化與生根作用。1984年Wang對草莓胚進行離體培養研究，結果表明，用MS培養基不添加激素僅誘導出愈傷組織，用含有0.5 mg/L BA的MS培養基或5～20 mg/L 2，4-D的MS培養基進行培養，可以誘導成胚并形成組織[39]。武書哲等以雜交后代未敗育種胚為試驗材料進行離體胚挽救，研究6-BA對無核葡萄希姆勞特胚發育的影響，結果表明，希姆勞特在含有0.5 mg/L 6-BA、1.5 mg/L IAA、0.5 mg/L GA3、5 g/L瓊脂、60 g/L蔗糖、1.0 mg/L活性炭，pH值為5.8的Nitsch培養基中胚發育成功率最佳[40]。田淑芬等為了研究外源添加物對無核葡萄胚珠發育與胚培養的影響，以希姆勞特×玫瑰香優系、紅寶石無核×玫瑰香優系雜交胚為試驗材料，研究 6-BA、甘氨酸與活性炭的不同濃度配比對葡萄胚珠生長發育的影響，結果表明，在紅寶石無核×玫瑰香優系胚發育率最適激素濃度方面，6-BA為0.5 mg/L，甘氨酸為4.00 mmol/L；在希姆勞特×玫瑰香優系雜交胚發育的最適濃度方面，甘氨酸是 1.00 mmol/L，相應的誘導率為17.33%；2個組合最適的活性炭濃度為1.0 g/L[41]。夏晶等用西伯利亞與黃天霸為親本進行百合雜交試驗，研究親本花粉活力，結果表明，GA3有利于胚發育前期迅速萌發，但后期發育長勢細弱，不利于成球[42]。杜學梅等對六月鮮棗幼胚進行離體培養研究，用開花后12～82 d的胚進行離體培養，結果表明，開花后70～72 d的胚適宜培養基為1/2MS+0.4 mg/L IBA(吲哚丁酸)+0.8 mg/L BA+500 mg/L LH(黃體生成素)+5 mg/L GA3+5%蔗糖，胚培苗經過擴繁后轉入1/2MS+1.0 mg/L IBA+0.06 mg/L IAA+2%蔗糖培養基上，獲得了健壯生根苗，生根苗移栽成活率達85%以上[43]。

3 結語

在植物特異種質資源創制和新品種選育研究方面，胚挽救技術應用特別廣泛，其發展速度也很快，可以加快植物育種進程。由于每種植物胚的發育條件差異，同時影響胚離體培養的因素很多，因而經常是不同作物胚挽救技術差別可能很大，甚至同一作物不同組合的胚挽救技術也有較大差異，很難一致化和程序化，因此在對植物進行胚挽救時對已有的相關胚挽救體系進行參考，并優化各種影響因素。