香蕉皮原花色素的酶解輔助提取及穩定性研究

賈寶珠 ，盧勝洪，方穗戀，鮑金勇，陳子鍵 ，楊公明 ，羅 林

（1.廣東第二師范學院生物與食品工程學院，廣東 廣州 510303；2.華南農業大學食品學院/廣東省食品質量與安全重點實驗室，廣東 廣州 510642）

賈寶珠，盧勝洪，方穗戀，等. 香蕉皮原花色素的酶解輔助提取及穩定性研究［J］.廣東農業科學，2018，45（11）：95-103.

香蕉是世界“四大水果”之一，在熱帶和亞熱帶地區廣泛種植［1］。在我國，香蕉年產量可達1 000萬t［2］。香蕉因其價格低、味道好、營養價值高深受人們喜愛。近年來，香蕉深加工產業迅速發展，除了鮮食香蕉外，市場上也涌現出了多種香蕉加工制品［3］。作為香蕉深加工的副產物，如若處理不當，對環境十分不利［4］。香蕉皮占香蕉總重的30%～40%，富含多酚［5-6］、纖維素［7］、果膠［8］、有機酸［9］、多糖［10］和蛋白質［11］等多種活性成分，還含有多種無機鹽和維生素，Ca、Mg、P、K的含量也相當豐富［12］，具有很高的研究和應用價值。原花色素具有很強的抗氧化和清除自由基作用［13-14］，被認為是一種天然抗氧化活性成分，目前已被廣泛應用于保健品、食品及化妝品等領域［15］。香蕉皮中含有大量的纖維素和果膠［16］，復合植物水解酶可以有效分解構成細胞壁及細胞間質的纖維素、半纖維素和果膠，將原花色素從細胞中釋放出來，從而提高原花色素的提取得率［17-18］。酶解輔助提取法高效、無毒、反應條件溫和，已廣泛應用于天然活性成分的提取［19-21］。

本研究采用酶解輔助提取法對香蕉皮中的原花色素進行提取，并對其穩定性進行研究，旨在提供一種優化的香蕉皮原花色素的提取方法和參數，為香蕉皮廢棄物的利用提供理論依據，對香蕉加工業的可持續發展具有重要的生態及經濟價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試青香牙蕉為市售，剝離果肉，備用；復合植物水解酶（酶活力≥1 500 NCU/g），諾維信（中國）生物技術公司；原花青素標準品（UV≥95%），天津市尖峰天然產物研究開發有限公司；乙醇、甲醇、鹽酸、香草醛為分析純，天津市富宇精細化工有限公司；檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀、氯化銅、氯化鐵、苯甲酸鈉、山梨酸鉀為分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

PL203電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；SHZ-88臺式水浴恒溫振蕩器，江蘇太倉市實驗設備廠；DGG-9070B電熱恒溫鼓風干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；DXF-04D手提式粉碎機，廣州市大祥電子機械設備有限公司；TDL-5-A飛鴿離心機，上海安亭科學儀器廠；RE-32A旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；752N紫外-可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 原花色素的制備、測定及標準曲線制作

1.2.1 原花青素制備 青香蕉皮，50℃烘干至水分含量低于10%，粉碎，過0.425 mm篩，得香蕉皮粉。準確稱取1.000 g香蕉皮粉，添加一定量的復合植物水解酶，調節體系pH值為4.4，在一定的溫度下酶解一定時間，得原花色素酶解液。在原花色素酶解液中加入乙醇，提取一定時間后，在4 000 r/min條件下離心20 min，取上清液減壓干燥，再于50℃恒溫烘箱烘干至含水量低于6%，得香蕉皮原花色素提取物。

1.2.2 原花色素提取得率測定 原花色素含量的測定采用香草醛-鹽酸法［22］，香蕉皮原花色素提取得率的計算公式如下：

式中，m0為提取所用香蕉皮粉的質量（g），m1為粗提品中原花色素的質量（g）。

1.2.3 標準曲線制作 準確稱取原花色素標準品0.010 g，用70%甲醇定容到50 mL，得到0.2 mg/mL原花色素標準液。分別移取原花色素標準液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于50 mL容量瓶中，用70%甲醇定容。分別取1.00 mL上述原花色素-甲醇溶液，加入6.00 mL質量分數4%的香草醛溶液和3.00 mL 36%～38%濃鹽酸，搖勻后避光反應30 min。以70%甲醇作空白，在500 nm處測吸光度。標準曲線方程為：y=1.4536x+0.0012，R2=0.9991。

1.3 酶解輔助提取法酶解試驗的工藝優化

1.3.1 單因素試驗設計 （1）酶添加量體積分數對原花色素提取得率的影響。分別以0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的酶添加量，在50℃條件下酶解60 min，再用65%乙醇以料液比1∶23（W/V，g/mL）、提取溫度50℃的條件下提取90 min，測定原花色素的提取得率。（2）酶解溫度對原花色素提取得率的影響。以0.6%的酶添加量，分別在35、40、45、50、55、60℃的條件下酶解60 min，再用65%乙醇以料液比1∶23、提取溫度50℃的條件下提取90 min，測定原花色素的提取得率。（3）酶解時間對原花色素提取得率的影響。以0.6%的酶添加量，在50℃條件下分別酶解15、30、45、60、75、90 min，再用65%乙醇以料液比1∶23、提取溫度50℃的條件下提取90 min，測定原花色素的提取得率。

1.3.2 正交實驗設計 在單因素試驗的基礎上，以原花色素的提取得率為考查指標，選擇酶解溫度、酶添加量、酶解時間3個因素，每個因素選取3個水平，采用L9（34）正交實驗。復合酶輔助提取法酶解試驗各因素水平的選取如表1所示。

表1 酶解正交實驗的因素及水平

1.4 酶解輔助提取法提取試驗的工藝優化

1.4.1 單因素試驗設計 （1）提取溫度對原花色素提取得率的影響。以0.8%的酶添加量，在50℃條件下酶解45 min，再用65%乙醇以料液比 1∶23，分別在 30、40、50、60、70、80℃提取溫度下提取90 min，測定原花色素的提取得率。（2）料液比對原花色素提取得率的影響。以0.8%的酶添加量，在50℃條件下酶解45 min，再用65%乙醇，分別以料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45（W/V，g/mL），提取溫度 50℃條件下提取90 min，測定原花色素的提取得率。（3）提取時間對原花色素提取得率的影響。以0.8%的酶添加量，在50℃條件下酶解45 min，再用65%乙醇以料液比1∶23，在50℃提取溫度下分別提取30、60、90、120、150 min，測定原花色素的提取得率。

1.4.2 正交實驗設計 在單因素試驗的基礎上，以原花色素的提取得率為考查指標，選擇提取溫度、料液比、提取時間3個因素，每個因素選取3個水平，采用L9（34）正交實驗。復合酶輔助提取法各因素水平的選取如表2所示。

表2 提取正交實驗的因素及水平

1.5 香蕉皮原花色素穩定性的研究

1.5.1 溫度對香蕉皮原花色素穩定性的影響（1）貯存溫度對香蕉皮原花色素穩定性的影響。配制濃度約為1.0 mg/mL的原花色素溶液，分別置于25、4、-18℃下貯藏5 d，每隔1 d測定1次原花色素含量，平行測定3次，觀察貯存溫度對香蕉皮原花色素穩定性的影響。（2）加熱溫度對香蕉皮原花色素穩定性的影響。配制濃度約為1.0 mg/mL的原花色素溶液，分別置于50、75、100℃水浴中保溫8 h，每隔2 h測定1次原花色素含量，平行測定3次，并按下式計算原花色素的保留率，觀察加熱溫度對香蕉皮原花色素穩定性的影響。

式中，m0為原溶液中原花色素的含量（mg/mL），m1為反應后溶液中原花色素的含量（mg/mL）。

1.5.2 檸檬酸、蘋果酸和抗壞血酸對香蕉皮原花色素穩定性的影響 將檸檬酸、蘋果酸和抗壞血酸分別添加到約1.0 mg/mL原花色素溶液中，使得溶液中檸檬酸、蘋果酸和抗壞血酸的濃 度 分 別 為 0、0.2、0.4、0.6、1.0和 2.0 mg/mL。將混合好的溶液在50℃下保溫8 h，每隔2 h測定1次原花色素含量，平行測定3次，并按1.5.1方法計算原花色素的保留率，觀察檸檬酸、蘋果酸和抗壞血酸對香蕉皮原花色素穩定性的影響。

1.5.3 金屬離子對香蕉皮原花色素穩定性的影響 將氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀、氯化銅和氯化鐵分別添加到約1.0 mg/mL原花色素溶液中，使得溶液中5種金屬離子的濃度為0、0.1、0.3、0.5 mol/L。將混合好的溶液在50℃下保溫8 h，每隔2 h測定1次原花色素含量，平行測定3次，并按1.5.1方法計算原花色素的保留率，觀察5種金屬離子對香蕉皮原花色素穩定性的影響。

1.5.4 防腐劑對香蕉皮原花色素穩定性的影響將苯甲酸鈉和山梨酸鉀分別添加到1.0 mg/mL原花色素溶液中，使得溶液中苯甲酸鈉和山梨酸鉀的濃度分別0、1.0、2.0和3.0 mg/mL。將混合好的溶液在50℃下保溫8 h，每隔2 h測定1次原花色素含量，平行測定3次，并按1.5.1方法計算原花色素的保留率，觀察苯甲酸鈉和山梨酸鉀對香蕉皮原花色素穩定性的影響。

2 結果與分析

2.1 香蕉皮原花色素酶解輔助提取法酶解試驗的工藝優化結果

2.1.1 酶添加量對香蕉皮原花色素提取得率的影響 由圖1可知，隨著酶添加量增加，原花色素的提取得率呈現先增大后平緩的趨勢。當酶添加量較少時，酶與底物結合充分，提取得率隨著酶添加量增加而提高；隨著酶添加量的升高，底物不足，未能對酶達到飽和，此時隨著酶添加量增加原花色素提取得率變化不顯著。因此，綜合考慮選擇0.8%為最適添加量。

圖1 酶添加量對香蕉皮原花色素提取得率的影響

2.1.2 酶解溫度對香蕉皮原花色素提取得率的影響 由圖2可知，隨著酶解溫度的升高，原花色素的提取得率呈現先增大后減小的趨勢。50℃時，原花色素的提取得率最高。溫度對原花色素的影響是雙重性的，隨著溫度升高，酶解反應速度加快，酶活力越大，然而溫度過高會使酶發生變性，酶解速率和酶解效果都會受到影響。因此，選擇50℃為最佳酶解溫度。

圖2 酶解溫度對香蕉皮原花色素提取得率的影響

2.1.3 酶解時間對香蕉皮原花色素提取得率的影響 由圖3可知，隨著酶解時間的延長，原花色素的提取得率呈現先增大后減小的趨勢。當酶解時間為45 min時，原花色素的提取得率最高。隨著酶解時間的延長，酶解逐漸完全，原花色素逐漸被釋放到溶液中，提取得率逐漸增大，但溶液中原花色素的含量不斷增多，會對酶促反應造成抑制；且原花色素暴露在細胞外時間過長，易被氧化和破壞。因此，選擇45 min為最佳酶解時間。

圖3 酶解時間對香蕉皮原花色素提取得率的影響

2.1.4 酶解輔助提取法酶解試驗的正交實驗結果 復合酶輔助提取法酶解試驗的L9（34）正交實驗結果見表3，分析極差R可知，影響香蕉皮原花色素酶解效果的因素大小順序為酶添加量（B）＞酶解溫度（A）＞酶解時間（C）。根據均值大小可知，酶解的最優條件為A2B2C2，該組合未在正交表中出現。在A2B2C2條件下重復試驗3次，所得原花色素的提取得率平均為1.655%，高于A2B2C3條件下的提取得率。因此，復合酶輔助提取法的最佳酶解條件為：酶解溫度50℃，酶添加量0.8%，酶解時間45 min。

表3 香蕉皮原花色素酶解輔助提取法酶解試驗的正交實驗結果

2.2 香蕉皮原花色素酶解輔助提取法提取試驗的工藝優化結果

2.2.1 提取溫度對香蕉皮原花色素提取得率的影響 由圖4可知，隨著提取溫度的升高，原花色素的提取得率呈現先增大后平緩的趨勢。當溫度達到70℃時，原花色素的提取得率最高。在一定范圍內，溫度的提高有利于原花色素的提取，但在高溫條件下，原花色素的結構遭到破壞，使得提取得率上升平緩甚至有所下降。因此，選擇70℃為最佳提取溫度。

2.2.2 料液比對香蕉皮原花色素提取得率的影響 由圖5可知，隨著料液比的增加，原花色素的提取得率呈現先增大后平緩的趨勢。當料液比為1∶25時，原花色素的提取得率最高。此時，原花色素幾乎全部被提取出來，繼續加大溶劑用量對提取效果無顯著影響。因此，選擇1∶25為最佳料液比。

圖4 提取溫度對香蕉皮原花色素提取得率的影響

圖5 料液比對香蕉皮原花色素提取得率的影響

2.2.3 提取時間對香蕉皮原花色素提取得率的影響 由圖6可知，隨著提取時間的延長，原花色素的提取得率呈現先增大后減小的趨勢。當提取時間為90 min時，原花色素的提取得率最高。原花色素的結構中含有大量羥基，長時間高溫加熱，會破壞其結構，使得提取得率降低。因此，選擇90 min為最佳提取時間。

2.2.4 酶解輔助提取法提取試驗的正交實驗結果 復合酶輔助提取法提取試驗的L9（34）正交實驗結果見表4。分析極差R可知，影響原花色素提取效果的因素大小順序為：料液比（C）＞提取時間（B）＞提取溫度（A）。根據均值大小可知，香蕉皮中原花色素提取的最優條件為A1B1C1，與正交實驗結果相符。在A1B1C1條件下試驗重復3次，所得原花色素的提取得率平均為1.702%。因此，復合酶輔助提取法的最佳提取條件為：料液比1∶23，提取溫度65℃，提取時間75 min。

圖6 提取時間對香蕉皮原花色素提取得率的影響

表4 香蕉皮原花色素酶解輔助提取法提取試驗的正交實驗結果

2.3 香蕉皮原花色素穩定性研究結果

圖7 溫度對香蕉皮原花色素穩定性的影響

2.3.1 溫度對香蕉皮原花色素穩定性的影響由圖7可知，隨著溫度的升高和時間的延長，香蕉皮原花色素的穩定性逐漸降低。由圖7A可知，當溫度較低時，香蕉皮原花色素相對較穩定。在室溫（25℃）、冰箱冷藏（4℃）和凍藏（-18℃）條件下貯存5 d，原花色素的保留率分別為88.11%、96.83%和99.24%。圖7B顯示，隨著加熱溫度的升高，原花色素降解速度逐漸加快。在50、75、100℃條件下加熱8 h，原花色素的保留率分別為88.62%、79.74%和56.77%。由此可見，低溫貯藏可較好地保護原花色素，而高溫加熱會破壞其穩定性。

2.3.2 檸檬酸、蘋果酸和抗壞血酸濃度對香蕉皮原花色素穩定性的影響 由圖8可知，隨著檸檬酸、蘋果酸和抗壞血酸濃度的增大，對香蕉皮原花色素的保護作用呈先增大后減小的趨勢。當溶液中檸檬酸、蘋果酸和抗壞血酸的濃度為0.6、0.6、0.4 mg/mL時，原花色素的穩定性最好，8 h后原花色素的保留率分別為94.90%、94.31%和96.34%。

2.3.3 金屬離子濃度對香蕉皮原花色素穩定性的影響 從圖9可以看出，隨著溶液中金屬離子濃度的增大，原花色素的穩定性逐漸降低。當溶液中Na+、Ca2+、K+、Cu2+和Fe3+的濃度為0.5 mol/L時，8 h后原花色素的保留率分別為81.78%、79.08%、81.73%、60.90%和40.52%。當溶液中加入Fe3+時，溶液由紅棕色變為紫黑色，且伴有少量絮狀沉淀產生；當溶液中加入Cu2+時，溶液變為青綠色。由此可見，Na+、Ca2+和K+對原花色素的穩定性影響較小，Cu2+和Fe3+對原花色素的穩定性破壞顯著。

圖8 檸檬酸、蘋果酸和抗壞血酸濃度對香蕉皮原花色素穩定性的影響

圖9 金屬離子濃度對香蕉皮原花色素穩定性的影響

2.3.4 防腐劑濃度對香蕉皮原花色素穩定性的影響 圖10顯示，隨著防腐劑濃度的增加，原花色素的穩定性逐漸降低。當苯甲酸鈉和山梨酸鉀的濃度為1.0（mg/mL）時，8 h后原花色素的保留率分別為85.71%和85.34%。可知，當防腐劑濃度較低時，其對原花色素的穩定性影響較小。

圖10 防腐劑濃度對香蕉皮原花色素穩定性的影響

3 結論與討論

本試驗結果表明，香蕉皮原花色素酶解輔助提取法酶解試驗的最佳工藝條件為：酶添加量0.8%，酶解溫度50℃，酶解時間45 min；提取試驗的最佳工藝條件為：料液比1∶23（g/mL），提取溫度65℃，提取時間75 min。在最佳工藝條件下，原花色素的提取得率為1.702%，與溶劑提取法的0.459%和超聲波輔助提取法的0.685%相比［23］，酶解輔助提取法的提取得率有了明顯提高。且酶解輔助提取法操作簡便、條件溫和、綠色環保，是目前天然產物提取較為常用的輔助手段。但是，本研究將酶解和提取兩個部分單獨進行，導致耗時較長，今后可進一步完善工藝流程，提高提取效率。

隨著溫度的升高和時間的延長，香蕉皮原花色素穩定性逐漸降低。因此，應將原花色素儲存在低溫環境中，在制備和使用的過程中也應盡量避免溫度過高。檸檬酸、蘋果酸和抗壞血酸對香蕉皮原花色素具有保護作用。因此，可以在原花色素的保存和使用過程中加入一定量的檸檬酸、蘋果酸或抗壞血酸作為保護劑。Na+、Ca2+、K+、Cu2+和 Fe3+等金屬離子會對香蕉皮原花色素起破壞作用，其中Cu2+和Fe3+的影響最為顯著。因此，在原花色素的制備、保存和使用過程中應盡量避免與Cu2+和Fe3+接觸。苯甲酸鈉和山梨酸鉀會降低香蕉皮原花色素的穩定性，但影響相對較小。因此，在保存和應用過程中可以適量加入苯甲酸鈉和山梨酸鉀。