多囊卵巢綜合征并胰島素抵抗大鼠高分子脂聯素表達及二甲雙胍的影響

張莉 高旭峰 王玉環

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種生殖異常和糖代謝紊亂并存的婦科內分泌性疾病，個體表現差異大，主要以高雄激素和/或胰島素抵抗為主要特點[1-3]。高分子量脂聯素(high-molecular weight Adiponectin,HMW APN)是脂聯素多聚體中最具生物活性的形式，具有調節糖、脂代謝，增加胰島素敏感性、抗炎、抗動脈粥樣硬化等作用[4]。不少研究發現HMW APN與胰島素抵抗關系密切。二甲雙胍既可以降低血糖，改善胰島素敏感性，又可以調節血脂，對PCOS患者臨床癥狀有一定作用。本實驗觀察PCOS大鼠血清HMW APN水平及二甲雙胍對HMW APN、性激素的調節作用及脂聯素基因的影響，分析PCOS大鼠體內血清HMW APN水平變化及其與生理生化指標的關系，或可為PCOS的發病機制研究提供新思路，為治療提供新的藥物靶點。

材料與方法

1.材料

(1) 動物：選用健康4周齡雌性SD(Sprague Dawley)大鼠共40只，清潔級，體重80～120 g(購買于西安交通大學醫學院實驗動物中心)。

(2) 試劑及儀器設備：包括來曲唑(美國Selleck公司)，二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司),胰島素、高分子脂聯素酶聯免疫試劑盒(上海嵐派生物科技有限公司)，酶標儀，恒溫孵育箱，移液槍、真空采血管(北京博奧森生物技術有限公司)，性激素放免試劑盒(天津德普公司)等。

2.方法

(1) 動物模型建立及分組：40只4周齡雌性SD大鼠，體重(100±20)g,耳標標記，使用隨機數字表平均分成4組：正常組(normal control，NC)、PCOS組、胰島素抵抗組(insulin resistance，IR)、PCOS-IR組。每組2籠，每籠 5 只。所有大鼠在第0周適應性喂養1周，動物室內設置晝夜12 h 循環，自由飲水及攝食。從第1周開始進行造模，將之前設定為IR組和PCOS-IR組的大鼠給予60%高脂飼料喂養，其余2組給予普通飼料，高脂喂養至實驗結束。PCOS造模期間每天4組大鼠在10:00、15:00分別做陰道涂片，連續監測14 d，直至明確獲得每只大鼠的一個完整性周期，40只大鼠均存在正常動情周期(圖1)，進入后續PCOS造模。第3周開始，之前設定為PCOS組和PCOS-IR組的大鼠給予灌服1 mg/kg的來曲唑溶解于1%羧甲基纖維素溶液,連續21 d[5-6]，NC組及IR組給予等體積1%羧甲基纖維素溶液。每日陰道液涂片并顯微鏡觀察、記錄涂片中細胞類型及判斷所處發情周期，若PCOS及PCOS-IR組大鼠完全失去周期性變化(即持續處于間情期)，提示PCOS造模成功(第5周)。第5周末4組大鼠取尾靜脈抽血測空腹血糖及空腹胰島素，計算HOMA-IR結果提示(表1)：IR組、PCOS組、PCOS-IR組的HOMA-IR 均高于NC組，且差異有統計學意義(P<0.05)，提示5周高脂飲食誘導SD大鼠產生胰島素抵抗，大鼠各組模型成功建立。造模過程中PCOS及PCOS-IR組大鼠各原因不明死亡2只，故造模成功后PCOS組為8只、PCOS-IR組為8只。

圖1 大鼠正常動情周期

組別n空腹血糖 (mmol/L)空腹胰島素 (mU/L)HOMA-IRNC組 104.13±0.8814.50±0.422.64±0.30IR組105.62±1.29*15.19±1.004.24±0.45*PCOS組85.07±0.9017.37±0.473.85±0.75*PCOS-IR組 86.06±0.45**21.90±0.745.72±0.37**

注:與NC組比較,*P<0.05,**P<0.001

(2) 實驗方法：從第6周起，二甲雙胍干預4周：PCOS-IR組給予二甲雙胍(0.5 mg/g)，NC組、IR組、PCOS組均給予等體積的生理鹽水。末次給藥后，禁食禁水12 h后，行 OGTT 試驗，以 50%葡萄糖溶液按 2 g/kg 灌胃，測 0 min、 30 min、 60 min 和 120 min 血糖，并留血清測OGTT胰島素水平。計算 AUC；后用10%水合氯醛，0.30 ml/100g腹腔注射進行麻醉，經腹主動脈取血到無抗凝劑的離心管中，4℃靜置20 min，離心，取血清，用于性激素等指標測定；分離取雙側卵巢，一側用10%福爾馬林溶液固定，留用于石蠟包埋切片，HE染色，另一側置 1.5 ml 無酶EP管中，-80℃冰箱保存，用于Real-Time PCR檢測。

(3) 大鼠陰道涂片方法:取待檢查的雌鼠置于操作臺上(避免未檢查大鼠受其影響)，安撫并清理毛上的墊料，拇指和食指捏住其尾巴，其余三指輕壓其后腰背部，翻起尾巴露出陰道口，清理糞便后，用棉簽蘸取少量生理鹽水在大鼠陰道涂抹數次，涂片，吉姆薩染液染色并采集圖片。

3.生化指標測定：血糖由羅氏血糖儀測定；穩態模型胰島素抵抗指數 (homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR)[7]：HOMA-IR=空腹胰島素×FBG/22.5；OGTT血糖曲線下面積(AUC)：曲線下面積=1/2×(0小時血糖值+0.5小時血糖值)×0.5+1/2×(2小時血糖值+0.5小時血糖值)×1.5=0.25×(0小時血糖值+4×0.5小時血糖值+3×2小時血糖值)。陰道涂片用吉姆薩染色觀察動情周期；放射免疫法檢測促卵泡生成素、促黃體生成素、睪酮(上海嵐派生物科技有限公司)；酶聯免疫吸附測定法檢測HMW APN、胰島素水平(上海嵐派生物科技有限公司)。

4.卵巢組織形態學觀察：HE染色，200及400倍光學顯微鏡下觀察卵巢形態學變化；RT-PCR檢測并分析卵巢組織中Adiponectin、 AdipoR1和AdipoR2表達水平。

結果

1.實驗中各組大鼠的空腹血糖及OGTT血糖變化

各組大鼠FBG(0周)差異無統計學意義(P>0.05)；造模成功時(第5周)，IR組、PCOS-IR組大鼠FBG分別與各自組0周FBG相比均增加(P<0.05)，PCOS組FBG較NC組FBG增加，但無統計學意義(P>0.05)，IR組、PCOS-IR組大鼠FBG較NC組FBG增加，有統計學意義(P<0.05)；第6周末，IR組與同齡NC組大鼠相比較，FBG增加(P<0.001)，兩組差異直到第12周末灌胃結束仍存在，PCOS-IR組大鼠與同齡NC組大鼠相比FBG無統計學差異(P>0.05)，直至灌胃結束；PCOS-IR組大鼠與同齡IR組、PCOS組大鼠相比，FBG降低有統計學意義(P<0.05)，直至灌胃結束。見表2。

表2 實驗中各組大鼠空腹血糖情況

注:與0周比較,△P<0.05; 與NC組比較,*P<0.05,**P<0.001; 與IR組比較,#P<0.05,##P<0.001; 與PCOS組比較，▲P<0.05

二甲雙胍干預后，與IR組，PCOS組相比，PCOS-IR組曲線下面積AUC減低(P<0.05)。與NC組大鼠相比，IR組、PCOS組曲線下面積均增加，但僅IR組曲線下面積增加有統計學意義(P<0.05)，即出現了一定程度的糖耐量降低。見表3。

表3 實驗中各組大鼠OGTT血糖情況

注:與NC組比較,*P<0.05,**P<0.001; 與IR組比較,#P<0.05,##P<0.001; 與PCOS組比較,▲P<0.05

2.實驗中各組大鼠的性激素改變

二甲雙胍干預后，與NC組相比，PCOS組、PCOS-IR組血清睪酮水平增加差異有統計學意義(P<0.05)，與IR組相比，PCOS組、PCOS-IR組黃體生成素增加(P<0.05)。PCOS組、IR組大鼠血清高分子脂聯素水平均較NC組降低且差異有統計學意義(P<0.05)；PCOS-IR組大鼠血清高分子脂聯素水平較NC組減低，但差異不明顯；PCOS-IR組大鼠血清高分子脂聯素水平較IR組及PCOS組增高，且差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 實驗中各組大鼠激素情況

注:與NC組比較,*P<0.05,**P<0.001; 與IR組比較,#P<0.05,##P<0.001; 與PCOS組比較,▲P<0.05，▲▲P<0.001

3.各組大鼠卵巢大體及HE染色形態

PCOS組、PCOS-IR組大鼠卵巢體積大，可見較多囊狀卵泡。

卵巢病理學改變：NC組、IR組可見不同發育階段的卵泡，卵泡內顆粒細胞呈現多層，多為8～9層(圖2-5 A、D)，PCOS組、PCOS-IR組可見囊性擴張的卵泡，黃體及各發育階段的卵泡相對較少，顆粒細胞成數少。見圖2。

4.高分子脂聯素及其受體基因表達情況

IR組、PCOS組較NC組Adiponectin基因表達均增加，但無統計學意義；PCOS-IR組較IR組、PCOS組Adiponectin基因表達有所降低(P<0.05)，PCOS-IR組卵巢AdipoR2基因的表達較PCOS組減少，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠卵巢組織Adiponectin及其受體mRNA表達水平

注:與IR組比較,#P<0.05; 與PCOS 組比較,▲P<0.05

5.各組大鼠血清高分子脂聯素與空腹血糖、空腹胰島素、性激素相關性分析

血清高分子脂聯素與空腹胰島素、HOMA-IR、睪酮呈正相關(r值分別為0.739、0.676、0.703，P<0.05)。

討論

多囊卵巢綜合征是育齡婦女不孕的重要原因之一，常見的表現有多毛、肥胖、月經紊亂、不孕，多伴發一些代謝紊亂和遠期并發癥，如高胰島素血癥、糖尿病、血壓升高、血脂譜異常、心血管疾病，甚至癌癥[8-9]。關于建立PCOS動物模型方法很多，有脫氫表雄酮誘導法、雄激素誘導法、孕激素聯合人絨毛膜促性腺激素誘導法及來曲唑誘導法等。這些仿動物內分泌及組織學方面的變化與臨床較接近[10]，符合PCOS動物的造模要求。不同方法在誘導PCOS動物模型時，卵巢變化及性激素改變存在差異。本研究為除外外用性激素對結果的影響，采用來曲唑誘導PCOS大鼠模型。本研究結果發現，PCOS組和PCOS-IR組大鼠無明顯的動情周期，即呈無排卵狀態；血清睪酮、黃體生成素水平分泌增加，呈高雄激素、高黃體生成素狀態，卵巢多囊樣變；兩組均出現的糖耐量異常，空腹胰島素、HOMA-IR均高于NC組。以上改變說明大鼠存在胰島素抵抗及生殖功能障礙，可以作為PCOS研究模型。

PCOS患者大多通過藥物治療，同時結合控制飲食、運動減輕體重的方法，很少進行手術治療，故臨床取材相對困難。IR在POCS的發生發展中發揮重要作用，故臨床上常應用改善IR的藥物，通過改善PCOS患者的糖脂代謝紊亂，進而改善患者體內激素水平達到治療的效果，增加排卵率。本研究應用二甲雙胍后PCOS-IR大鼠糖耐量異常和卵巢狀態均有所改善(P<0.05)。但大鼠HOMA-IR改善不明顯，可能與用藥時間相對較短有關。二甲雙胍并非專治PCOS的藥物，只是針對存在胰島素抵抗及糖脂代謝異常的PCOS患者可能發揮一些作用，并非對所有患者都有效。因此，進一步探索PCOS的更詳細發病機制，找到治療PCOS患者安全、有效的藥物仍存在很大的挑戰。

高分子脂聯素是脂聯素多聚體中最具生物活性的一種形式[11]，具有調節糖、脂代謝、增加胰島素敏感性、抗炎、抗動脈粥樣硬化等作用[4]。研究發現，相較總脂聯素，HMW-APN與IR[3]、代謝綜合征、PCOS[12]的關系更密切，HMW APN或可作為PCOS防治的潛在物質，為PCOS的病理生理機制研究提供新思路，為治療提供新的藥物靶點。一項針對PCOS青年患者研究發現[3]，體內存在胰島素抵抗的PCOS患者血清HMW APN明顯減少，且HMW APN與胰島素抵抗呈負相關。血清HMW APN水平降低可能是PCOS患者體內胰島素抵抗和代謝異常的一個決定因素。Wickham等[13]將PCOS患者分為正常雄激素組和高雄激素組進行對比發現，相較正常雄激素組，高雄激素組患者血清 HMW-APN 明顯減少，胰島素抵抗也明顯增加。故在PCOS患者體內HMW APN與IR呈負相關，與胰島素敏感性呈正相關[13-14]。本研究發現PCOS組、IR組大鼠血清高分子脂聯素水平均較NC組降低(P<0.001)；PCOS-IR組大鼠血清高分子脂聯素水平較PCOS組增加(P<0.001)；同時PCOS-IR組高分子脂聯素基因表達較IR組、PCOS組降低(P<0.05)；IR組、PCOS組高分子脂聯素基因表達較NC組增加，但差異不明顯，可能是由于IR組、PCOS組大鼠糖代謝、性激素紊亂導致血清高分子脂聯素分泌減少，機體代償性使其基因表達增加。也可能由于二甲雙胍用藥時間相對較短，這種差異未完全表現出，說明二甲雙胍可以通過影響PCOS-IR大鼠的高分子脂聯素基因表達，改善胰島素抵抗的同時改善PCOS的癥狀。

綜上，血清高分子脂聯素在胰島素抵抗大鼠、PCOS大鼠中表達均減少。二甲雙胍可以調節糖代謝水平，減輕PCOS大鼠卵巢多囊性改變，增加HMW APN水平，從而達到改善PCOS的目的。下一步需要對二甲雙胍是通過何種機制影響高分子脂聯素水平來達到改善PCOS的目的進行深入研究。

(圖2見封底)