線粒體功能異常與卵巢衰老關(guān)系的研究進(jìn)展

楊慧 孫若蕓 馬瑞紅 夏天 高慧

線粒體是顆粒細(xì)胞內(nèi)含量最豐富的細(xì)胞器，卵母細(xì)胞線粒體是卵母細(xì)胞質(zhì)中含量最為豐富的細(xì)胞器，若線粒體功能下降可能會(huì)影響卵母細(xì)胞質(zhì)量，進(jìn)而導(dǎo)致卵母細(xì)胞的老化，甚至卵巢衰老[1]。目前研究認(rèn)為，卵巢衰老的分子生物學(xué)機(jī)制主要包括 DNA損傷修復(fù)[2]、端粒縮短[3]、代謝紊亂和線粒體功能異常。本文對(duì)線粒體與卵巢衰老相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行綜述，以了解線粒體與卵巢衰老之間的關(guān)系，為臨床上提高卵巢衰老有關(guān)的不孕癥治療的妊娠率提供理論依據(jù)。

一、線粒體功能

在真核細(xì)胞中，線粒體是唯一含有DNA的細(xì)胞器。電鏡顯示線粒體由內(nèi)外雙層膜封閉環(huán)繞成桿形或顆粒形，內(nèi)膜向線粒體基質(zhì)皺褶形成嵴。基質(zhì)中存在參與三羧酸循環(huán)的酶類，并且含有Ca2+、Mg2+等離子。線粒體DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)多存在線粒體嵴上，并呈雙鏈環(huán)狀致密結(jié)構(gòu)，基因組全序列長(zhǎng)度為16.6 kb，共編碼37種基因，每個(gè)線粒體內(nèi)有2～10個(gè)mt DNA 拷貝數(shù)。卵母細(xì)胞內(nèi)含有2種基因組，即核DNA(nuclear DNA,n DNA)和mt DNA，而線粒體功能需要的大部分蛋白質(zhì)由核基因編碼，由n DNA和mt DNA共同調(diào)控完成[4]。卵母細(xì)胞中線粒體及mt DNA是最多的。線粒體在機(jī)體內(nèi)不僅作為能量工廠為細(xì)胞供能，為細(xì)胞活動(dòng)提供幾乎全部的能量來(lái)源，還具有維持細(xì)胞內(nèi)的鈣離子的穩(wěn)態(tài)、參與細(xì)胞凋亡過(guò)程、合成嘧啶和血紅素等重要的生理功能。故目前認(rèn)為，線粒體主要有以下4個(gè)功能：(1)產(chǎn)生ATP；(2)產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)；(3)參與細(xì)胞凋亡途徑；(4)維持鈣離子平衡。

二、線粒體與卵巢衰老

1.線粒體數(shù)量與卵巢衰老

年齡是影響卵母細(xì)胞質(zhì)量的重要原因之一[5]。而細(xì)胞內(nèi)線粒體的數(shù)量會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而發(fā)生變化。女性隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體的抗氧化能力逐漸降低，細(xì)胞內(nèi)的氧自由基減少，ROS堆積，卵母細(xì)胞線粒體長(zhǎng)期暴露在ROS堆積的環(huán)境中，線粒體出現(xiàn)基因突變、功能異常的可能性會(huì)增加，進(jìn)而直接影響到卵母細(xì)胞的質(zhì)量[6]。Simsek-Duran[7]等通過(guò)透射電子顯微鏡觀察不同年齡階段老鼠卵母細(xì)胞線粒體后發(fā)現(xiàn)，和年輕的老鼠相比，老齡鼠卵母細(xì)胞中的線粒體的數(shù)量明顯減少，最終導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量的下降。

2.mt DNA與卵巢衰老

線粒體擁有自己獨(dú)立的遺傳物質(zhì)—mt DNA，是獨(dú)立于n DNA之外、通過(guò)母系遺傳的一組遺傳物質(zhì)。mt DNA拷貝數(shù)減少及mt DNA突變率增加導(dǎo)致線粒體功能異常，進(jìn)而影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量以及胚胎發(fā)育狀況。

在細(xì)胞中，mt DNA編碼呼吸鏈上13種蛋白，其中包括復(fù)合體Ⅰ中7個(gè)亞基、復(fù)合體Ⅲ中1個(gè)亞基、復(fù)合體Ⅳ中3個(gè)亞基、復(fù)合體Ⅴ也就是ATP合酶的2個(gè)亞基。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)可檢測(cè)人成熟卵子中mt DNA含量約為20 000～800 000個(gè)拷貝數(shù)不等[8]。而mt DNA拷貝數(shù)對(duì)卵母細(xì)胞的受精和早期胚胎發(fā)育有重要影響，可用來(lái)評(píng)價(jià)胚胎的質(zhì)量[9]。mt DNA拷貝數(shù)下降，可影響線粒體呼吸鏈上13種蛋白質(zhì)亞基的轉(zhuǎn)錄及翻譯，導(dǎo)致線粒體供能異常，影響受精卵和胚胎發(fā)育的質(zhì)量。與n DNA相比，mt DNA沒(méi)有組蛋白的保護(hù)，而是被核基因編碼的線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM或mTFA)蛋白包裹著，無(wú)有效的修復(fù)系統(tǒng)，處于高自由基環(huán)境中，故mt DNA更容易遭受氧化應(yīng)激，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)突變，表達(dá)發(fā)生改變，引起呼吸鏈功能障礙，ATP減少，進(jìn)一步增加mt DNA突變率及ROS產(chǎn)生進(jìn)入惡性循環(huán)中。有文獻(xiàn)報(bào)道，mt DNA突變率和死亡率是nDNA的20倍左右[10]。當(dāng)其受到不可修復(fù)的氧化應(yīng)激時(shí)，線粒體呼吸鏈會(huì)被中斷，線粒體的膜電位平衡被打破，線粒體氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS) 能力降低，合成三磷酸腺苷(adenosine trisphosphate,ATP)的能力減弱，最終導(dǎo)致卵母細(xì)胞的受精率和胚胎發(fā)育能力降低[11]。Santos[12]等通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，受精的卵子中mt DNA拷貝數(shù)比退化的卵子中的數(shù)量要高許多，也就是說(shuō)，可以通過(guò)檢測(cè)卵母細(xì)胞中的mt DNA的拷貝數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞的質(zhì)量。

另外也有研究證實(shí)[13]，隨著女性年齡的增加，卵母細(xì)胞中的mt DNA的突變率和缺失率會(huì)顯著增高。Hsieh[14]等指出，隨著女性年齡增長(zhǎng)，卵母細(xì)胞中mt DNA拷貝數(shù)減少、轉(zhuǎn)錄水平降低，女性卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能降低。目前為止，研究人員已經(jīng)找出了超過(guò)150種不同的mt DNA突變方式，其中最常出現(xiàn)的是Δmt DNA 4977片段缺失，該片段重排突變現(xiàn)象成為衰老的一個(gè)重要標(biāo)志[15]。

3.ROS與卵巢衰老

正常情況下，機(jī)體內(nèi)促氧化劑水平與抗氧化劑水平處在一種動(dòng)態(tài)平衡之中。適量的ROS能夠維持細(xì)胞的生理功能，不僅參與調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、啟動(dòng)有絲分裂及防御病原體等，而且還參與卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟、排卵、黃體功能及卵泡閉鎖等過(guò)程[16]。若ROS產(chǎn)生過(guò)量或細(xì)胞抗氧化機(jī)制受損時(shí)，超出機(jī)體清除ROS的最大負(fù)荷量，體內(nèi)ROS過(guò)量累積會(huì)引發(fā)細(xì)胞氧化應(yīng)激(oxidative stress,OS)反應(yīng)，破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，最終可能導(dǎo)致DNA損傷、8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷 (8-hydroxy-desoxyguanosine,8-OHdG) 的形成[17]，引起細(xì)胞的衰老及凋亡。褪黑色素(melatonin,MT)及其代謝產(chǎn)物可直接作為自由基清除劑，參與調(diào)控卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育、促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟和改善黃體功能，降低 ROS 產(chǎn)生并抑制 8-OHdG 形成，從而保護(hù)DNA 免受于氧化應(yīng)激的損傷[18]。

顆粒細(xì)胞在活動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生的抗氧化酶是清除ROS的主要因素，但隨年齡的增長(zhǎng)，卵母細(xì)胞中抗氧化物酶的活性逐漸降低，進(jìn)而影響卵母細(xì)胞質(zhì)量。有研究顯示，在飲食和基因突變誘發(fā)的肥胖模型中，卵母細(xì)胞的氧化應(yīng)激標(biāo)記物(如ROS等) m RNA表達(dá)水平顯著升高及抗氧化標(biāo)記物(如GSH-Px、SOD和CAT等)明顯減少[19]，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，從而改變卵母細(xì)胞線粒體的分布，降低卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟，破壞紡錘體形態(tài)并減少卵母細(xì)胞極性，最終導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量下降。有文獻(xiàn)證實(shí)[20]，ROS與抗氧化劑之間的平衡能夠?qū)β涯讣?xì)胞的發(fā)育產(chǎn)生重大的影響，隨著女性年齡的增大，機(jī)體的抗氧化能力降低，二者之間的平衡被打破，因此機(jī)體內(nèi)會(huì)累積過(guò)多的ROS，損壞線粒體的功能，容易攻擊線粒體膜，破壞其氧化磷酸化，使線粒體產(chǎn)生ATP的能力降低，線粒體基質(zhì)中鈣離子的儲(chǔ)存降低，細(xì)胞質(zhì)中的鈣離子水平增加。然而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的鈣離子濃度增加可引起細(xì)胞功能的紊亂，通過(guò)激活線粒體凋亡通路導(dǎo)致細(xì)胞減數(shù)分裂周期停滯和細(xì)胞凋亡[21]。另外，ROS抑制鈉鈣交換體活性和鈣離子信號(hào)分子鈣調(diào)蛋白活性，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子儲(chǔ)存減少、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子增加，從而使鈣離子穩(wěn)態(tài)出現(xiàn)異常[22]，降低卵母細(xì)胞質(zhì)量，導(dǎo)致卵母細(xì)胞凋亡。

三、線粒體替代療法改善卵母細(xì)胞質(zhì)量

卵母細(xì)胞數(shù)量減少及卵母細(xì)胞質(zhì)量下降共同作用可導(dǎo)致卵巢衰老，隨著年齡的增長(zhǎng)女性卵母細(xì)胞數(shù)量呈遞減趨勢(shì)，故可改善卵母細(xì)胞質(zhì)量而延緩卵巢衰老。而在卵母細(xì)胞中，線粒體的含量最多，它不僅作為能量工廠提供能量ATP，并且還維持鈣離子的穩(wěn)態(tài)等生理功能，起著重要作用，是卵巢衰老的決定性因素[23]。因此理論上可以通過(guò)改善線粒體功能或增加線粒體數(shù)量[24]來(lái)實(shí)現(xiàn)提高卵母細(xì)胞質(zhì)量的目的。

近年來(lái)，越來(lái)越多的不孕患者通過(guò)輔助生殖技術(shù)得以受孕。對(duì)高齡不孕患者以及反復(fù)治療失敗的不孕患者，學(xué)者們嘗試?yán)镁€粒體替代療法這一新的生殖工程技術(shù)來(lái)改善卵母細(xì)胞質(zhì)量提高助孕率[25]。線粒體替代療法即體外分離供體細(xì)胞的線粒體，通過(guò)顯微注射植入MⅡ卵細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)卵細(xì)胞成熟并提高受精發(fā)育能力，其中包括原核移植、線粒體移植或胞漿移植、紡錘體移植和極體移植等，并取得了一定療效[26]。目前線粒體移植取得很大的進(jìn)展且具有一定的前景。2015年初，英國(guó)首先批準(zhǔn)了線粒體移植技術(shù)用以治療不孕[27]。異體線粒體移植有異質(zhì)性問(wèn)題及倫理問(wèn)題，故線粒體移植必須取自自身細(xì)胞并且含有高質(zhì)量、沒(méi)有基因缺失或突變的線粒體[28]。Tzeng等[29]在2001年首次報(bào)道，應(yīng)用患者自體卵丘顆粒細(xì)胞線粒體移植至卵母細(xì)胞進(jìn)行輔助生殖并且成功實(shí)現(xiàn)了3例臨床妊娠。在自體線粒體移植過(guò)程中卵巢干細(xì)胞(ovarianstem cells,OSC)為自體線粒體的優(yōu)選。因顆粒細(xì)胞與卵細(xì)胞緊挨著，對(duì)卵細(xì)胞成熟發(fā)育的整個(gè)過(guò)程發(fā)揮著重要作用，因此，顆粒細(xì)胞的線粒體與卵細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)及作用大致相似，為最佳的供體。

因此，自體生殖系干細(xì)胞線粒體移植(autologous germline mitochondrial energy transfer,AUGMENT)為改善卵細(xì)胞質(zhì)量提供了新的方向[30]。它通過(guò)ICSI將來(lái)源于OSC的線粒體與精子一起注射到卵母細(xì)胞中,最大限度地避免異質(zhì)化風(fēng)險(xiǎn)并改善卵母細(xì)胞質(zhì)量。線粒體的替代療法在操作的安全性及倫理性仍有爭(zhēng)議，故在臨床上還未被廣泛應(yīng)用，需要進(jìn)一步研究印證其有效性及安全性[31]。

四、展望

綜上所述,線粒體是卵巢衰老的決定因素，線粒體的功能與卵母細(xì)胞質(zhì)量密切相關(guān)。目前有很多研究已顯示線粒體的功能對(duì)卵母細(xì)胞的質(zhì)量有重要的影響，但其中的影響機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。近年來(lái)，隨著“二胎”政策的開(kāi)放，越來(lái)越多的高齡女性進(jìn)入備孕，為深入了解線粒體與卵母細(xì)胞衰老的關(guān)系并探索改善卵母細(xì)胞質(zhì)量的方法。通過(guò)改善線粒體質(zhì)量的手段提高卵子質(zhì)量和妊娠率，提供更優(yōu)化的助孕策略，將具有重要意義。