TLR4/NF-κB表達(dá)升高促進(jìn)宮頸癌增殖和轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制

蔡靜 張丹 張燕

Toll樣受體(Toll-like receptors；TLRs)作為主要的固有免疫受體類型，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，啟動(dòng)繼發(fā)性損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。TLR-4作為TLRs家族的重要成員，在識(shí)別并結(jié)合損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns；DAMPs)，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TLR-4通過與相應(yīng)受體結(jié)合，啟動(dòng)下游的髓樣分化因子88(MyD88)依賴/Myd88非依賴信號(hào)通路，進(jìn)而激活核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、分泌大量細(xì)胞因子[2]。近年研究表明，慢性炎癥與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，而介導(dǎo)炎癥的TLR4與多種腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)，是近年來研究熱點(diǎn)之一[3]。在膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤的研究中已經(jīng)證明，TLR4表達(dá)上調(diào)明顯，且TLR1到TLR10均有不同程度表達(dá)升高。有文獻(xiàn)報(bào)道，TLR4在宮頸癌中表達(dá)明顯增高，且表達(dá)程度與腫瘤病變程度呈高度相關(guān)性[4]。但是，目前TLR4在宮頸癌中表達(dá)增加的作用尚不明確，其是否影響宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移仍有待進(jìn)一步探討。

因此，本研究擬檢測宮頸癌組織和宮頸癌細(xì)胞中TLR4/NF-κB表達(dá)改變，并通過干擾TLR4表達(dá)，觀察TLR4對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響。

資料與方法

一、資料

收集本院于2017年4月—2018年4月就診并行手術(shù)治療的患者術(shù)中宮頸癌組織及癌旁組織31例，診斷依據(jù)病理結(jié)果。人宮頸癌細(xì)胞株HCE1由我院實(shí)驗(yàn)中心提供，兔多克隆抗體TLR4，Myd88，ERK1/2及NF-κB均購自美國Abcam公司，Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測試劑盒購自中國碧云天公司，DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，Trizol Reagent購自Invitrogen公司，mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司，PCR mix購自日本Toyobo公司，TLR4 沉默與過表達(dá)質(zhì)粒均購自中國百奧邁科生物技術(shù)有限公司。

二、方法

1. 采用實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)比較宮頸癌組織及癌旁組織中TLR4/ NF-κB的表達(dá)。根據(jù)人宮頸癌細(xì)胞株HCE1細(xì)胞TLR4表達(dá)情況，分為Blank 、陰性對(duì)照、TLR4沉默、TLR4過表達(dá)4組。采用CCK8、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測TLR4對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，并進(jìn)一步檢測Myd88，ERK1/2 及NF-κB信號(hào)分子改變。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：常規(guī)培養(yǎng)人宮頸癌細(xì)胞株HCE1及原代宮頸上皮細(xì)胞。在細(xì)胞生長穩(wěn)定、呈對(duì)數(shù)期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

3.分組與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：接種人宮頸癌細(xì)胞株HCE1，在37 ℃ 5% CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中，含 10% FBS 的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，50%～60% 融合時(shí)，采用Lipofectamine 3000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。共分4組： Blank 組：常規(guī)培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞；陰性對(duì)照(negative control，NC)組：轉(zhuǎn)染TLR4 NC(100 nmol/ml)的宮頸癌細(xì)胞；TLR4沉默組：轉(zhuǎn)染TLR4 siRNA(100 nmol/ml)的宮頸癌細(xì)胞；TLR4過表達(dá)組：轉(zhuǎn)染TLR4 過表達(dá)質(zhì)粒(100 nmol/ml)的宮頸癌細(xì)胞。嚴(yán)格按照脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，6 h 內(nèi)用 OMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

4.qRT-PCR：獲得患者癌組織及癌旁組織，以及相應(yīng)細(xì)胞系樣本，均嚴(yán)格按照RNAgent Isolation System說明書，抽提總RNA。取1 ug總RNA，嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)在PE公司的GeneAmp8 5700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，嚴(yán)格按照SYBR green說明書加樣，總反應(yīng)體系20 ul，各樣本加cDNA 2ul；SYBR green 10 ul；商品化引物 2 ul(TLR4，NF-κB，上海生工，中國；GAPDH:MQP027158;Genecopoeia公司，美國)；RANaseRree去離子水 2 ul。按兩步法反應(yīng)94℃ 30 s，58℃ 30 s，反復(fù)40個(gè)循環(huán)以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照進(jìn)行分析。

5.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：在96孔板中每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞剛好貼壁記為0 h，于12 h利用CCK-8檢測試劑盒檢測細(xì)胞增殖；每孔加入10 ul CCK-8溶液，空白對(duì)照孔加10 μl 0.9%生理鹽水，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，然后用酶標(biāo)儀在570 nm處測定各孔的吸光度(A)值。

6.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞按每孔約5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種到6孔板，培養(yǎng)24 h至細(xì)胞伸展，用無菌200ul的槍頭在細(xì)胞層垂直、快速劃痕。標(biāo)準(zhǔn)條件培養(yǎng)48 h后觀察劃痕愈合。

7.侵襲實(shí)驗(yàn)：Transwell小室(Millipore，USA)底部鋪入50 ul Basement Membrane Matrix(Corning, USA，1:2稀釋)，置于細(xì)胞孵箱中2 h。收獲細(xì)胞，制成每200 ul DMEM(GIBECO，USA)中含6×104個(gè)細(xì)胞懸液。Transwell上室加入200 ul DMEM細(xì)胞懸液，下室加入800 ul含10%胎牛血清DMEM，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中。侵襲48 h后取出小室，多聚甲醛中固定10 min，結(jié)晶紫中染色3 min。PBS洗凈結(jié)晶紫，并用棉簽輕輕擦拭Transwell小室上室底部。晾干后，將小室倒置于顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)算細(xì)胞數(shù)目。

8.Western blot檢測：按不同因素處理細(xì)胞，提取蛋白，測定蛋白濃度，采用5×上樣緩沖液稀釋，使用12%分離膠電泳，轉(zhuǎn)膜90min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST漂洗10 min×3次，用5%TBST稀釋的BSA稀釋一抗，分別與膜接觸4℃孵育過夜后，用TBST漂洗10min×3次，加二抗室溫下孵育1 h 后，用TBST 洗膜10 min× 3 次，在Gene Gnome曝光儀上曝光并拍照。

結(jié) 果

一、TLR4/NF-κB在組織和細(xì)胞中的表達(dá)：在mRNA水平，腫瘤組織TLR4的表達(dá)顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)；宮頸癌細(xì)胞株HCE1中TLR4的相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常宮頸上皮細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，見圖1A。腫瘤組織NF-κB的表達(dá)顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011)；HCE1中NF-κB的相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常宮頸上皮細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)，見圖1B。

圖1 TLR4/NF-κB在不同組織和細(xì)胞中的表達(dá)比較Figure 1 Comparison of TLR4/NF-κB expression in different tissues and cells

二、TLR4對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響：TLR4沉默組HCE1細(xì)胞增殖能力(0.8±0.4)較NC組(1.2±0.4)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022)；而TLR4過表達(dá)組HCE1細(xì)胞增殖能力(1.9±0.5)較NC組(1.2±0.4)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)，見圖2。

三、TLR4對(duì)細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響：TLR4沉默組細(xì)胞愈合面積比例顯著低于NC組(P=0.001)，而TLR4過表達(dá)組細(xì)胞愈合面積比例顯著高于NC組(P=0.001)，見圖3C。另外，TLR4沉默組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于NC組(P=0.001)，而TLR4過表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯多于NC組(P<0.000)，見圖3D。結(jié)果提示，過表達(dá)TLR4可以促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移、侵襲。

圖2 細(xì)胞增殖能力改變Figure 2 Changes in cell proliferationCompared with NC group, #P<0.05.

圖3 細(xì)胞遷移、侵襲能力改變Figure 3 Changes in cell migration and invasivenessCompared with NC group, #P<0.05.

四、Myd88/NF-κB信號(hào)通路表達(dá)改變：為進(jìn)一步探究TLR4促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞株HCE1增殖、遷移和侵襲的機(jī)制，結(jié)果顯示，TLR4沉默組Myd88(P=0.015)，pERK1/2(P=0.007)及pNF-κB(t=2.762,P=0.024)表達(dá)顯著低于NC組，而TLR4過表達(dá)組Myd88(P=0.001)，pERK1/2(P=0.001)及pNF-κB(P=0.011)表達(dá)顯著高于NC組，見圖3。由此可見，TLR4可通過激活Myd88，ERK1/2及NF-κB信號(hào)分子，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，見圖4。

圖4 不同組別細(xì)胞Myd88，pERK1/2及pNF-κB蛋白表達(dá)改變Figure 4 Expression of Myd88, pERK1/2 and pNF-κB in different groups

討 論

Medzhitov等于1997年發(fā)現(xiàn)人類第一個(gè)與果蠅Toll蛋白相似的蛋白受體-TLR4。TLR4是TLR家族11亞型中最重要的成員，研究最多，不僅廣泛表達(dá)于NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫原性細(xì)胞，也表達(dá)于膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤[5]。近年研究表明，慢性炎癥與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，而介導(dǎo)炎癥的TLR4與多種腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)，是近年來研究熱點(diǎn)之一。

研究表明，TLR4在很多腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)。Yang等報(bào)道在人乳腺癌細(xì)胞中，TLR1到TLR10均有不同程度表達(dá)升高，尤其是TLR4表達(dá)上調(diào)最明顯[1]。有研究發(fā)現(xiàn)大腸癌中TLR4的表達(dá)顯著高于癌旁組織，且與TGF-β、VEGF之間表達(dá)存在明顯相關(guān)性[6-7]。在宮頸癌中，有文獻(xiàn)報(bào)道，TLR4在腫瘤組織中的表達(dá)明顯增高，且表達(dá)程度與腫瘤病變程度呈密切相關(guān)性[8]。通過本研究進(jìn)一步證實(shí)，TLR4、NF-κB在宮頸癌及宮頸癌HCE1細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)明顯增高。

目前，TLR4與宮頸癌病變程度相關(guān)性的機(jī)制仍不清楚。有研究認(rèn)為，TLR4信號(hào)傳導(dǎo)途徑在腫瘤形成、凋亡抵抗和侵襲過程中發(fā)揮重要作用[9]。有研究表明，TLR4信號(hào)途徑激活NF-κB促進(jìn)炎性因子的產(chǎn)生，并激活A(yù)P-1促進(jìn)生長因子的產(chǎn)生[10]。在膠質(zhì)瘤中的研究表明，TLR4/NF-κB信號(hào)通路的過度激活與膠質(zhì)瘤的侵襲、增殖密切相關(guān)[11]。但是，TLR4/NF-κB信號(hào)通路與宮頸癌增殖、遷移的關(guān)系目前仍缺乏文獻(xiàn)報(bào)道。我們的研究證實(shí)，在宮頸癌中沉默TLR4的表達(dá)，可以顯著抑制宮頸癌增殖、遷移、侵襲，而過表達(dá)TLR4可顯著增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲。另外，TLR4下游的Myd88，ERK1/2及NF-κB信號(hào)分子隨著TLR4表達(dá)改變而改變。

目前，腫瘤微環(huán)境在促進(jìn)腫瘤增殖、遷移與侵襲中的作用逐漸受到重視。研究表明，通過激活TLR4受體，介導(dǎo)MyD88、IRAK、TRAF6、IKK信號(hào)途徑激活，最終激活NF-κB，促進(jìn)IL-1、IL-6、TNF-A等大量炎癥因子的產(chǎn)生。而此類炎癥因子有助于腫瘤細(xì)胞逃逸免疫原性細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞攻擊，促進(jìn)腫瘤遷移。研究報(bào)道TLR4激活后可促進(jìn)腫瘤生長和抵抗化學(xué)治療，阻止TLR4激活則能減緩腫瘤生長及延長動(dòng)物的生存期[12]。在宮頸癌中，過表達(dá)TLR4是否通過影響腫瘤微環(huán)境的機(jī)制促進(jìn)腫瘤增殖、遷移、侵襲仍有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，TLR4/NF-κB在宮頸癌中過度激活，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。通過沉默TLR4可以抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。在宮頸癌中，TLR4/NF-κB可能發(fā)揮促癌作用，可能是抗癌藥物的重要靶點(diǎn)。