血漿miRNA-135a及尿AD7c-NTP在輕度認知損害患者中的檢測價值

胡軼虹 孫宏俠 白春艷 李宗樹 劉敏 張明明 呂金珠 楊春麗

(吉林省人民醫院神經內科，吉林 長春 130021)

阿爾茨海默病(AD)是一種慢性進行性神經變性疾病，目前尚無有效的治療方法。因此，國內外專家一直致力于尋找癥狀早期的診斷性工具〔1〕，以利于早識別，早干預。本文在前期工作的基礎上〔2〕，聚焦于輕度認知損害(MCI)階段，檢測患者的血漿miRNA-135a及尿AD7c-NTP水平，探討其作為MCI早期診斷標志物的價值。

1 材料和方法

1.1實驗分組 (1)正常對照(AMC)組，年齡≥60歲，保留正常的日常生活活動能力，無神經系統疾病，精神疾病及其他可導致認知功能損害的醫療情況。(2)MCI組，年齡≥60歲，用簡易智力狀態檢查量表(MMSE)及臨床癡呆評定量表(CDR) 進行認知功能臨床評價。認知損害診斷標準：①21分≤MMSE≤28分；②非癡呆；③記憶力減退主訴；④保存一般認知功能；⑤較完整的日常生活活動能力(允許2個或更少的問題：電話、準備三餐，理財，完成家務)；⑥根據教育程度的校正：12年以下+1分，6年以下+2分。根據頭電子計算機斷層掃描(CT)或磁共振成像(MRI)影像學檢查及Hachinski缺血量表評分分為①血管源性(VD)-MCI組：Hachinski缺血量表評分≥7分伴有影像學腦血管病改變；②AD-MCI組：Hachinski缺血量表評分<4分且無影像學腦血管病改變。排除標準：①確診癡呆；②中樞神經系統感染、頭顱損傷、癲癇、多發性硬化、中毒代謝性疾病、帕金森病、顱內腫瘤、甲狀腺功能減退；③抑郁癥、精神分裂癥；有酒精或藥物依賴史；服用相關改善認知的藥物；④合并嚴重心、肝、腎、腦及造血系統疾病。三組均行全面體格檢查和神經系統檢查，實驗室檢查(即血常規、尿常規、血生化、維生素B12和葉酸水平、甲狀腺功能、同型半胱氨酸)和神經影像學(MRI或CT)檢查。本研究所有受試者知情同意。篩選2016～2018年吉林省人民醫院神經內科門診及住院患者，根據入組標準，共篩選出80例，年齡60～94歲，其中AMC組28例，男13例，女15例，年齡中位數69歲；VD-MCI組28例，男19例，女9例，年齡中位數72歲；AD-MCI組24例，男13例，女11例，年齡中位數73歲。三組性別構成差異無統計學意義(P=0.199)，年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2血漿標本采集 空腹12 h后，用乙二胺四乙酸(EDTA)真空采血管采血，立即在1 380 r/min離心5 min。樣本保存在4℃等待血漿制備，其后用1.5 ml EP管分裝，儲存在-80℃，直到進一步使用。

1.3尿液標本采集 受試者留取晨尿的中段尿，選取清亮的標本，經尿液分析測定，如有下列中任何一種異常即為不合格標本：①尿蛋白異常；②尿液中白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)異常或有細菌生長；③尿中有結晶；④尿比重異常；⑤pH異常；⑥尿糖、酮體、硝酸鹽、膽紅素或尿膽原陽性。合格的標本進行離心(2 500 r/min，離心10 min)，過濾，取上清液置于-80℃冰箱密封保存備用。從取尿液到存入冰箱在2 h內完成。

1.4小RNA提取及miRNA-135a測定 應用miENeasy Mini Kit(Qiagen，德國)，逆轉錄試劑盒 (Qiagen，德國)，2×SYBR qPCR試劑盒(EZBioscience，上海)，按照說明書進行RT-qPCR，以cel-miR-39為外參，使用2-ΔΔCT法計算miRNA-135a水平。

1.5尿AD7c-NTP測定 應用AD7c-NTP試劑盒(朗頓，上海)通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，酶標儀450nm測定吸光度，計算樣品濃度。

1.6統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t、χ2檢驗、方差分析。miRNA-135a及AD7c-NTP水平與MMSE評分相關性用Pearson相關系數分析。

2 結 果

2.1各組血漿miRNA-135a水平比較 AMC組血漿miRNA-135a水平為(9.87×10-7±5.66×10-7)，VD-MCI組血漿miRNA-135a水平為(4.17×10-7±8.35×10-8)，AD-MCI組血漿miRNA-135a水平為(2.83×10-7±1.72×10-7)，三組miRNA-135a水平差異有統計學意義(F=30.76，P=0.00)。

2.2各組尿AD7c-NTP水平比較 AMC組尿AD7c-NTP水平為(285.83±89.12)ng/L，VD-MCI組尿AD7c-NTP水平為(353.02±96.96)ng/L，AD-MCI組尿AD7c-NTP水平(418.57±112.32)ng/L，三組尿AD7c-NTP水平差異有統計學意義(F=9.96，P=0.00)。

2.3MMSE評分與miRNA-135a水平相關性 對VD-MCI組MMSE評分與血漿miRNA-135a水平進行Pearson相關性分析，結果顯示二者間無明顯相關性(r=0.20，P=0.31)。對AD-MCI組MMSE評分與血漿miRNA-135a水平進行Pearson相關性分析，結果顯示二者間無明顯相關性(r=0.24，P=0.25)。

2.4MMSE評分與尿AD7c-NTP水平相關性 通過Pearson相關性分析，VD-MCI組MMSE評分與尿AD7c-NTP水平無明顯相關性(r=0.18，P=0.46)。AD-MCI組MMSE評分與尿AD7c-NTP水平無顯著相關性(r=-0.31，P=0.14)。

3 討 論

目前用于AD診斷的特異性生物學指標有腦脊液中β淀粉樣蛋白1～42，總tau蛋白，磷酸化tau181P蛋白〔3，4〕。然而，CSF的侵襲性收集過程限制了這些檢測方法的日常臨床使用。miRNA是一類非編碼小分子RNA，通過調控轉錄后基因表達發揮其生物學功能。近年來研究發現，miRNA在大腦發育、神經元分化、突觸聯系和樹突棘形成等過程中發揮重要作用〔5〕。miRNA 能夠分泌至血漿或腦脊液等外周體液〔6〕，而且 miRNA 經囊泡運輸或與高密度脂蛋白緊密結合，可以在外周體液中穩定存在〔7〕；同時，外周體液中的miRNA 水平隨大腦中 miRNA 水平變化而變化，且變化幅度也十分相近。因此，通過外周血液檢測miRNA可能輔助AD診斷。Liu等〔8〕研究發現，APP/PS1雙轉基因AD小鼠模型海馬組織中miRNA-135a較野生型小鼠顯著下調，且AD小鼠模型CSF和血清中的miRNA-135a亦顯著下調。由于miRNA-135a相對BACE1和Aβ42而言處于生物級聯作用的上游，故miRNA-135a可能對于AD的早期診斷有潛在幫助。這個猜想也在與Aβ42陽性率的橫向比較中得以印證-外周血miRNA-135a可能是較Aβ42更適宜的AD診斷〔9〕，特別是早期診斷的標志物。本研究發現miRNA-135a在輕度認知損害患者中降低，在AD源性MCI中降低更為明顯，證明miRNA-135a可作為AD源性MCI早期篩選診斷標志物。

AD7c-NTP由De La Monte等〔10〕于1997年首次在晚期AD患者的顳葉腦組織中用抗胰腺絲蛋白抗體分離并命名，是一種分子量為41 kD的跨膜磷蛋白，主要在神經元中表達，定位于神經細胞的軸突，并且在AD患者腦內選擇性增高〔11〕。研究表明，增高的AD7c-NTP可從早期的AD 患者腦脊液及尿樣本中檢測到，而且腦脊液及尿液中AD7c-NTP水平與癡呆的嚴重程度相關〔12〕。 AD源性MCI作為AD的早期有癥狀階段，其腦中發生的病理變化與AD相似，陳英道等〔13〕研究發現AD7c-NTP在AD源性MCI患者的腦脊液及尿液中含量均升高，且診斷的靈敏度及特異度較高。本研究發現AD7c-NTP在所有MCI的患者中均有升高，但AD源性MCI組升高更為明顯，說明AD7c-NTP可作為AD源性MCI篩選診斷標志物。而將血漿miRNA-135a與尿AD7c-NTP相結合，可進一步提高診斷的準確性。