骨橋蛋白在兒童中樞神經系統白血病中的表達及髓外浸潤機制的研究

王春靜　方希敏　陳森敏　劉仕林

[摘要]目的 探討骨橋蛋白（OPN）在兒童中樞神經系統白血病（CNSL）中的表達以及髓外浸潤的機制。方法 選取2016年1月～2018年1月我院收治的10例CNSL患兒、20例非CNSL急性白血病患兒以及20例非腫瘤疾病患兒，分別標記為觀察組、對照組及常規組。通過ELISA檢測三組患兒治療前以及觀察組與對照組患兒完全緩解后血清中的OPN含量，并通過RT-PCR檢測三組患兒治療前以及觀察組與對照組患兒完全緩解后的骨髓OPN表達情況。將培養的白血病Jurkat細胞分為空轉組與轉染組，其中空轉組不做任何處理，轉染組將合成OPN特異性的siRNA轉染到Jurkat細胞中。對比分析培養的白血病Jurkat細胞空轉組與轉染組的OPN表達情況、細胞存活率以及細胞侵襲力。結果 治療前，觀察組患兒的血清OPN含量及骨髓OPN表達均高于對照組與常規組，差異有統計學意義（P<0.05）;對照組患兒的血清OPN含量及骨髓OPN表達均高于常規組，差異有統計學意義（P<0.05）。完全緩解后，觀察組與對照組患兒的血清OPN含量及骨髓OPN表達均低于治療前，差異有統計學意義（P<0.05）;完全緩解后，觀察組患兒的血清OPN含量及骨髓OPN表達高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。轉染組白血病Jurkat細胞的OPN表達、細胞存活率以及下層浸潤細胞數與總細胞數比率均低于空轉組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 OPN在兒童CNSL患兒的表達中高于非CNSL急性白血病及其他腫瘤疾病患兒，并且其在白血病細胞浸潤中樞神經系統中起著一定的作用。

[關鍵詞]中樞神經系統白血病;骨橋蛋白;急性白血病;ELISA檢測

[中圖分類號] R543.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）11（a）-0008-05

Study of osteopontin expression in childhood central nervous system leukemia and its mechanism of extramedullary infiltration

WANG Chun-jing? ?FANG Xi-min? ?CHEN Sen-min? ?LIU Shi-lin

Department of Hematology and Oncology， Shenzhen Children′s Hospital， Guangdong Province， Shenzhen? ?510038， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of osteopontin （OPN） in children′s central nervous system leukemia （CNSL） and the mechanism of extramedullary infiltration. Methods From January 2016 to January 2018， 10 children with CNSL， 20 children with non-CNSL acute leukemia and 20 children with non-neoplastic diseases treated in our hospital were selected and labeled as observation group， control group and routine group respectively. The levels of OPN in serum of children in three groups before treatment and after complete remission in observation group and control group were detected by ELISA. The expression of OPN in bone marrow of children in three groups before treatment and after complete remission in observation group and control group was detected by RT-PCR. Cultured Jurkat cells were divided into blank group and transfection group， in which the blank group did not do any treatment， and the transfection group transfected the synthetic OPN-specific siRNA into Jurkat cells. The expression of OPN， cell viability and invasiveness of cultured Jurkat cells were compared between the blank group and the transfected group. Results Before treatment， the serum OPN content and bone marrow OPN expression in the observation group were higher than those in the control group and the routine group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The level of serum OPN and the expression of bone marrow OPN in the control group were higher than those in the routine group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. After complete remission， the serum OPN content and bone marrow OPN expression in the observation group and the control group were lower than those before treatment， and the differences were statistically significant （P<0.05）. After complete remission， the serum OPN content and bone marrow OPN expression in the observation group were higher than those in the control group， with statistical significance （P<0.05）. The expression of OPN， cell viability and ratio of infiltrating cells to total cells in the lower layer in the transfected group were lower than those in the blank group， with statistical significance （P<0.05）. Conclusion The expression of OPN in children with CNSL is higher than that in non-CNSL children with acute leukemia and other cancer diseases， and it plays a certain role in leukemia cell infiltration into the central nervous system.

[Key words] Central nervous system leukemia; Osteopontin; Acute leukemia; ELISA detection

在兒童白血病中，急性淋巴細胞白血病合并中樞神經系統白血病（central nervous system leukemia，CNSL）的發生率低，但復發率高達14.5%，嚴重威脅患兒的身心健康甚至生命安全[1]。臨床治療上，白血病的髓外浸潤是治療白血病的難點，同時也是白血病復發的重要因素[2]。Lazarus等[3]的研究顯示，中樞神經系統白血病患者5年生存率低于非中樞神經系統浸潤的白血病患者。因此，研究兒童白血病在體內的浸潤過程機制以及如何防治CNSL是目前醫護人員以及醫學界面臨的嚴峻考驗。有諸多研究表明[4-6]骨橋蛋白（osteopontin，OPN）在乳腺癌、胃癌、淋巴癌等多類惡性腫瘤細胞中均存在相當程度的異常表達情況，具有“腫瘤轉移基因”一說。也有研究[7]指出，OPN在急性髓性白血病中是潛在的預后和治療的靶點所在，同時CNSL的發生發展與OPN的受體CD44高表達存在著明顯的相關性。OPN屬于一種分泌性磷酸化糖蛋白，具有多種生物學活性，在介導細胞黏附、參與免疫應答、抑制細胞凋亡等過程中均有重要地位。本研究通過檢測OPN在兒童CNSL中的含量以及表達情況、檢測下調OPN表達后白血病細胞株Jurkat細胞存活率和浸潤力變化，為OPN在白血病髓外浸潤機制提供客觀參考依據，為后續CNSL的防治提供一個有效的靶點，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2016年1月～2018年1月我院收治的10例中樞神經系統白血病（CNSL）患兒作為觀察組，20例非CNSL急性白血病患兒作為對照組，20例非腫瘤疾病患兒作為常規組。

觀察組中，男6例，女4例;年齡32～84個月，平均（49.4±7.4）個月;CNSL分型：急性淋巴細胞白血病7例，急性髓細胞白血病3例。納入標準：①患白血病且合并腦脊液中白細胞計數>5×106/L;②MRI檢測結果提示大腦塊狀病變或腦脊膜被浸潤;③首次確診為CNSL且未進行放療或化療等治療。

對照組中，男12例，女8例;年齡28～79個月，平均（50.6±7.1）個月。納入標準：①確診為急性白血病，同時排除CNSL以及睪丸白血病等髓外入侵;②細胞形態學符合FAB分型;③符合免疫學分型;④患兒初次確診為急性白血病且尚未進行治療。

常規組中，男15例，女5例;年齡34～83個月，平均（48.7±8.2）個月。納入標準：①非白血病以及非其他腫瘤疾病患兒;②進行脊髓臨床檢查，如免疫性血小板減少癥骨髓涂片一般檢查、骨髓培養等。

三組均排除臨床資料不完整的患兒。三組患兒的性別、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。三組患兒家屬對本研究均知情且簽署自愿參與同意書，本研究已經我院醫學倫理委員會審核批準。

1.2方法

觀察組與對照組患兒急性淋巴細胞白血病以華南地區兒童急性淋巴細胞白血病治療協作組2016年的方案為標準，并于化療的第33天進行復查;髓系白血病以華南協作組方案化療后28～35 d為復查時間點。

1.2.1 ELISA檢測血清中OPN含量? 采集觀察組、對照組及常規組治療前的靜脈血液各2 ml，并采集觀察組及對照組患兒經過治療完全緩解后的靜脈血液各2 ml。經離心處理后存于冰箱中，溫度設置-80℃。解凍后采用人OPN ELISA試劑盒，按照試劑盒說明書操作步驟配合丹麥丹尼酶標儀（MK-3）進行處理分析。

1.2.2 RT-PCR檢測骨髓OPN表達? 采集觀察組、對照組及常規組骨髓各2 ml，并采集觀察組及對照組患兒完全緩解后的骨髓各2 ml，均儲存于-196℃液氮條件下，解凍后以淋巴細胞分離液分離出單個核細胞，在TRIzol試劑盒的使用下分別提取各自RNA，后以基因庫中人OPN完全mRNA系列為基準設計其引物。使用PE9600 PCR儀合成OPN基因，后經變性、退火、延伸步驟并反復循環獲得產物進行瓊脂糖凝膠電泳測定，并與紫外線下行光密度掃描后拍照。

1.2.3培養白血病Jurkat細胞并轉染? 采用含10%胎牛血清的RPMI-1640細胞培養液培養白血病Jurkat細胞，培養條件：飽和濕度、37℃、5% CO2培養箱。3 d后換液，以1∶3的比例進行傳代。將培養的白血病Jurkat細胞分為空轉組與轉染組，其中空轉組不做轉染處理，轉染組將合成OPN特異性的siRNA通過pLKO-Tet-On質粒載體轉染到Jurkat細胞中（siRNA正義鏈序列5′-TAAGGACAGTTATGAAACGAGTTTC AAGAGAACTCGTTTCATAACTGTCCTTTTTTTTC-3′）。在白血病Jurkat細胞培養階段至對數生長期后，將細胞懸浮液調整至2×107/L，后接種至96孔細胞培養板中，每孔加入100 μl細胞懸浮液。在適當條件下進行細胞轉染。

1.2.4 Western-Blot檢測白血病Jurkat細胞OPN表達? 將白血病Jurkat細胞空白組與轉染組培養2 d后，以PBS洗滌，在1000 r/min的條件下離心5 min，吸除培養液上清，加入蛋白裂解液進行充分裂解，吸取蛋白上清，以BCA蛋白濃度檢測試劑盒按照說明書步驟進行定量檢測。

1.2.5 MTT檢測Jurkat細胞存活率? 將白血病Jurkat細胞空轉組與轉染組培養2 d后，每孔加入MTT溶液20 μl，在37℃、5% CO2條件下孵育4 h后在1000 r/min的條件下進行離心5 min，再在細胞沉淀中加入200 μl二甲基亞砜溶液，在37℃下震蕩10 min后進行比色（490 nm）。

1.2.6 Matrigel檢測白血病Jurkat細胞侵襲力? 將Matrigel稀釋至5 ng/ml，取80 μl至于孔徑為8 μm的millicell底面，在37℃條件下24 h成膠后置于24孔培養板中，millicell槽中分別加入2×105/ml的白血病Jurkat細胞，在37℃、5% CO2條件下培養24 h。之后以棉簽擦拭掉底面未穿膜的細胞后以甲醇固定，進行Gimsa染色處理，在400倍光鏡下技術膜背面細胞數，取6個視野穿過膜到達外表面的細胞平均數，并將下層也混勻后計細胞數。

1.3觀察指標

①觀察三組患兒治療前血清中的OPN含量及骨髓OPN表達情況，其中骨髓OPN表達情況通過光密度掃描結果比值進行判定。②比較觀察組及對照組患兒完全緩解前后OPN含量及骨髓OPN的表達情況。③分析培養的白血病Jurkat細胞空轉組與轉染組的OPN表達情況、細胞存活率以及細胞侵襲力，細胞侵襲力通過下層浸潤細胞數與總細胞數比率進行判定。

1.4統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1三組患兒治療前血清OPN含量及骨髓OPN表達情況的比較

治療前，觀察組患兒的血清OPN含量高于對照組與常規組，差異有統計學意義（P<0.05）;對照組患兒治療前的血清OPN含量高于常規組，差異有統計學意義（P<0.05）。光密度掃描結果比值顯示，觀察組患兒的骨髓OPN表達高于對照組及常規組，差異有統計學意義（P<0.05）;對照組患兒的骨髓OPN表達高于常規組，差異有統計學意義（P<0.05）（表1、圖1）

2.2觀察組與對照組患兒治療前及完全緩解后血清OPN含量及骨髓OPN表達情況的比較

觀察組治療完全緩解的有7例，對照組治療完全緩解的有19例。治療前，觀察組患兒的血清OPN含量高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;兩組患兒治療完全緩解后的血清OPN含量均低于治療前，差異有統計學意義（P<0.05）;觀察組完全緩解后的血清OPN含量高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。光密度掃描結果比值顯示，觀察組患兒治療前的骨髓OPN表達高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;兩組患兒完全緩解后的骨髓OPN表達低于治療前，差異有統計學意義（P<0.05）;觀察組患兒完全緩解后的骨髓OPN表達高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）（表2、圖2）。

2.3 Jurkat細胞空轉組與轉染組OPN表達、細胞存活率以及下層浸潤細胞數與總細胞數比率的比較

轉染組白血病Jurkat細胞的OPN表達、細胞存活率以及下層浸潤細胞數與總細胞數比率均低于空轉組，差異有統計學意義（P<0.05）（表3、圖3）。

3討論

中樞神經系統白血病是指腦膜、腦神經以及腦組織被白血病細胞浸潤，若得不到及時診斷發現與有效治療可嚴重危害患者的生命安全。白血病中樞神經系統浸潤是一個復雜的過程，包含白血病細胞的黏附、細胞突破基底膜等[8]，而OPN在該一系列過程中扮演者重要的角色[9]。OPN通過識別RGD序列和非RGD序列與細胞膜上的整合素受體相結合，從而促進細胞與細胞、細胞與基質之間的黏附[10]。此外，OPN可與αvβ3作用，通過激活核因子κB途徑，抑制細胞凋亡。Lee等[11]的研究顯示，將OPN導入胃癌AZ521細胞，而后通過激活Src途徑作用于CD44V，從而抑制UV有道細胞凋亡。Powell等[12]的研究顯示，敲除掉OPN后能促進白血病細胞死亡，提示在急性髓性白血病中OPN是一個潛在的預后和治療的靶點。

本研究結果顯示，兒童CNSL患兒血清OPN的含量以及骨髓OPN的表達遠遠高于非CNSL白血病以及非白血病及其他腫瘤疾病患兒，差異有統計學意義（P<0.05），提示OPN在白血病細胞浸潤至中樞神經系統起著一定的作用。而通過對白血病Jurkat細胞轉染合成OPN特異性的siRNA，可以顯著降低其OPN的表達、細胞存活率以及細胞浸潤力（P<0.05），該研究結果肯定并支撐著以上結論。同樣，Liersch等[13]檢測到OPN在AML患者中的表達明顯高于正常對照組，且OPN高表達是AML預后不良的一個獨立危險因素，并發現復發的AML患者其OPN表達明顯升高。這與本文研究結果相一致。此外國內有研究顯示，OPN受體CD44高表達與CNSL發生有著明顯的關系，同時也指出 OPN和血管內皮生長因子（VEGF）與急性白血病的發生、發展密切相關[14-15]。

綜上所述，OPN在兒童CNSL的表達較急性白血病（非CNSL）和非腫瘤疾病患者中要高，通過下調OPN在白血病Jurkat細胞中的表達能夠有效降低白血病細胞的存活率與侵襲力，提示OPN在白血病細胞浸潤中樞神經系統起著一定程度的作用，本研究結果可作為OPN成為中樞神經系統白血病防治的有效靶點提供參考。

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（收稿日期：2019-05-16? 本文編輯：閆? 佩）