Sigma-1受體激活減輕心臟缺血再灌注損傷

廖小平, 喻溥蛟,許嘉鴻

(1.上海市安亭醫院心血管內科,上海201805;2.同濟大學附屬同濟醫院心血管內科,上海200065)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)已成為目前發病率及死亡率非常高的疾病之一[1].僅在美國,每年就有約150萬人發生急性心肌梗死.而隨著生活水平的提高以及生活方式的改變,目前我國的急性心肌梗死發病率也逐漸升高.而隨著再灌注治療技術的發展,急性的心肌梗死已能夠在發生的短期內得到有效治療.盡管極大地提高了急性心肌梗死患者的存活率,但也催生出了新的問題.心臟缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)指的是心肌梗死罪犯血管打開后,快速血流重新流入心肌,在途經受損的心肌細胞時由血液中HbO2造成二次打擊的氧化應激損傷[1-3].這種損傷往往會造成心肌細胞的進一步壞死和凋亡、存活心肌細胞的線粒體功能障礙、蛋白激酶的激活、大量的炎癥反應等,繼而導致患者的遠期預后不良,甚至死亡[4-5].因此,如何改善心臟缺血再灌注損傷是目前心血管病領域一個亟待解決的重要問題.

Sigma-1受體是一個長度為25 kD的分子伴侶,主要位于內質網以及線粒體相關的內質網膜上[6],可以通過調節鉀離子通道、電壓敏感性的鈣離子通道來調節鈣離子進入細胞膜的濃度,還可以調節胞漿內儲存的鈣離子流通,促進蛋白的折疊,提高細胞對于氧化應激反應的抗性[7-9].Sigma-1受體廣發地分布在身體的各個組織中,包括心臟、大腦、肺臟、腎臟等[10].已有研究發現,sigma-1受體對于多種器官的缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)有著重要的調節作用[11-14].Sigma-1受體的配體之一——BHDP(N-benzyl-N'-(2-hydroxy-3,4-dimethoxybenzyl)-piperazine,N-芐基-N'-(2-羥基-3,4-二氧芐基)-哌嗪),能夠有效改善肝臟受到的氧化應激反應[11].在大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型中,使用sigma-1受體激動劑氟伏沙明,能夠通過Akt介導的NO信號通路顯著改善腎臟功能,提高大鼠的存活率[12].而在心臟相關的研究中,研究者也發現,sigma-1受體參與了心臟重構的病理生理過程[15-20],sigma-1受體激動劑SA4503以及氟伏沙明都可以改善壓力負荷所致的心臟重構,保護心臟功能不受損.然而,sigma-1受體在心臟缺血再灌注損傷中的作用尚不清楚.因此,本工作的目的旨在探索sigma-1受體對于心臟缺血再灌注損傷的作用,以期為心臟缺血再灌注的診療提供一個全新的分子靶點.

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 實驗動物

雄性C57BL/6小鼠,8～10周齡,質量28±1 g,飼養于SPF級動物房,溫度22±2°C,濕度50%～60%.所有操作均依照美國國立衛生院(National Institutes of Health,NIH)的相關規定.

1.1.2 實驗儀器

多功能酶標儀、微量移液器、旋渦混勻器、恒溫水浴鍋、離心機、半干轉膜槽、電泳儀、電泳凝膠成像系統、倒置顯微鏡、體視鏡、顯微手術器械、小動物呼吸機.

1.1.3 實驗試劑

實驗中所涉及的抗體包括一抗Bcl-2抗體、Bax抗體、Caspase-3、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrgenase,GAPDH)抗體,均購于Abclonal公司.Sigma-1受體激動劑SA4503以及抑制劑BD1047購于Sigma公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 動物實驗方案

采用冠脈結扎法構建小鼠的缺血再灌注模型.8周齡的C57BL/6小鼠經過3 d的尾靜脈注射藥物SA4503(1 mg·kg-1·d-1)以及BD1047(1 mg·kg-1·d-1)后進行手術. 手術步驟如下:①手術區域用75%的酒精擦拭消毒;②用1%戊巴比妥鈉按0.01 mL/g濃度腹腔注射麻醉小鼠;③在聲門下兩個氣管軟骨環之間切一個小孔,插入氣管插管,固定;④打開胸腔,用7-0線將冠狀動脈左前降支弓結扎;⑤逐層關胸,用6-0縫線固定肋骨,4-0縫線縫皮;⑥用5 mL注射器通過胸管邊抽氣邊拔出胸管,避免術后發生氣胸;⑦30 min后,再次打開胸腔,將結扎的線剪斷,關閉胸腔,縫合肋骨和皮膚;⑧24 h后收取心臟樣本.

1.2.2 四氮唑紅染色方法

心臟損傷的評估方式采用TTC/Evans藍雙染色法,其中TTC為四氮唑紅(2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride).首先,將2%的Evans藍通過冠脈結扎的方式,僅灌注于心臟未缺血部分,未著色的部分稱為危險區(area at risk,AAR).接著從小鼠體內快速取出心臟,置于-20°C冰箱中冷凍,冰凍后用刀片將心臟橫切為1～2 mm厚度的切片.將切片浸泡于37°C的1%TTC溶液中孵浴15 min后使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)漂洗.TTC未著色部分心肌組織呈現白色,為壞死的心肌組織,視為梗死區(infarction area,INF),著色的紅色區域為缺血但未壞死的組織.染色后使用倒置顯微鏡拍攝心肌切片照片,利用ImageJ軟件對圖形進行量化分析.

1.2.3 蛋白的提取

取適當大小的心肌組織樣本,加入適量的細胞裂解液,用勻漿機將組織樣本破碎.隨后置于冰上裂解樣本15 min.接下來,將蛋白樣品置于離心機中以12 000 r/min離心30 min后,將蛋白上清液轉移至新的離心管中,加入上樣緩沖液后100°C使蛋白變性,迅速放入冰中冷卻,短時離心.采用標準牛血清白蛋白(albumin from bovine serum,BCA)定量方法對樣本進行蛋白含量均一化后待用.細胞裂解液配方(以1 mL為例)如下:1 mL細胞裂解液,10μL磷酸酶抑制劑,10μL苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF).

1.2.4 免疫印跡法

根據目的蛋白的分子量配制不同濃度的分離膠,一般大多采用濃度為8%,10%與12%的分離膠.電泳條件如下:電壓80 V(濃縮膠)～120 V(分離膠),電泳時間約2～3 h,溴酚藍至膠底邊即可停止電泳.選用聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)作為蛋白轉膜載體,轉膜條件為恒流200 mA轉2 h.轉在PVDF上的樣品用PBS配制5%的BSA作為封閉液常溫封閉處理1 h后,用PBST(PBS溶液加上Tween-20)清洗干凈.一般按照1∶1 000的比例用5%BSA配置一抗,并將樣品于4°C冰箱內孵育一抗過夜.第二天棄去一抗,用PBS清洗干凈后,用5%BSA按照1∶10 000的比例配制二抗,并于常溫孵育二抗2 h.使用化學發光顯影試劑對蛋白表達情況進行檢測.

1.2.5 統計方法

數據以均值±標準差(mean±SD)表示,使用SPSS 17.0統計軟件進行方差分析,3組及3組以上單因素樣本運用單因素方差分析(analysis of variance,ANOVA),方差齊性時再運用Bonferroni分析作兩兩比較.統計結果以P＜0.05為具有統計學差異.

2 結果

2.1 Sigma-1受體抑制劑BD1047對小鼠心臟缺血再灌注損傷的影響

為了明確sigma-1受體對于心臟缺血再灌注損傷的作用,首先檢測了使用sigma-1受體抑制劑后小鼠心臟缺血再灌注損傷的面積.經過3 d的尾靜脈注射sigma-1受體抑制劑BD1047后發現,接受了BD1047預處理后的小鼠心肌受損面積即梗死區與危險區比值(INF/AAR)要遠大于對照組,如圖1所示,圖中LV為左心室(left ventricle),***代表P＜0.01,n=6.

圖1 BD1047對心臟缺血再灌注損傷面積的影響Fig.1 Effects of BD1047 on myocardial infarction size induced by MIRI

2.2 Sigma-1受體抑制劑BD1047對心肌細胞中凋亡相關蛋白表達的影響

同時,在蛋白水平使用了蛋白免疫印跡法檢測心肌組織中的凋亡相關蛋白,結果發現,相較于對照組,BD1047組的抗凋亡相關蛋白Bcl-2表達明顯下調,而與促凋亡相關的蛋白Bax以及Capase-3的活化水平明顯升高,如圖2所示,圖中*代表P＜0.05,**代表P＜0.01,***代表P＜0.001,n=3.

2.3 Sigma-1受體激動劑SA4503對小鼠心臟缺血再灌注損傷的影響

在明確了抑制sigma-1受體對心臟缺血再灌注損傷有協同作用后,檢測了sigma-1受體的激活對小鼠心臟缺血再灌注損傷的作用.經過3 d的尾靜脈注射sigma-1受體激動劑SA4503后發現,接受了SA4503預處理后的小鼠心肌受損面積要遠小于對照組(見圖3,圖中***代表P＜0.001,n=6).

2.4 Sigma-1受體激動劑SA4503對心肌細胞中凋亡相關蛋白表達的影響

同樣地,在蛋白水平使用蛋白免疫印跡法檢測心肌組織中的凋亡相關蛋白,結果發現,相較于對照組,SA4503組的抗凋亡相關蛋白Bcl-2表達明顯上調,而與促凋亡相關的蛋白Bax以及Capase-3的活化水平明顯降低(見圖4,圖中*代表P＜0.05,**代表P＜0.01,n=3).

圖2 BD1047對Bax,Bcl-2以及Caspase-3蛋白表達的影響Fig.2 Effects of BD1047 on expression of Bax,Bcl-2 and Caspase-3 proteins

圖3 SA4503對心臟缺血再灌注損傷面積的影響Fig.3 Effects of SA4503 on myocardial infarction size induced by MIRI

3 討論

隨著藥物溶栓、經皮冠狀動脈介入治療、冠脈旁路移植術等再灌注治療技術日益完善且廣泛普及,心臟再灌注損傷的干預治療備受重視.目前,已有觀點多集中于心肌梗死后缺血再灌注引起的氧化應激損傷及其產生的強烈炎癥反應.這些損傷反應的最終結果是大片細胞的壞死和進一步的心肌細胞凋亡.

圖4 SA4503對Bax,Bcl-2以及Caspase-3蛋白表達的影響Fig.4 Effects of SA4503 on expression of Bax,Bcl-2 and Caspase-3 proteins

通常來說,心肌細胞凋亡發生在心肌梗死缺血后的幾分鐘內[21-22]以及冠脈閉塞被打通后血液再灌注時[23].一些基礎研究以及臨床試驗認為,凋亡是心臟缺血再灌注損傷最重要的病理生理機制[24].當再灌注發生時,血流快速恢復的同時帶來了大量的氧分子以及細胞外pH值的變化,這些均導致氧自由基的釋放以及鈣離子的超載,繼而發生線粒體膜滲透性的增加,線粒體通透性轉換孔的開放,進而導致更多的促凋亡因子從線粒體中被釋放出來[24-29].

Sigma-1受體本身對于線粒體離子通道有著重要的調控作用.本工作的研究中發現了抑制sigma-1受體將會加重小鼠心臟缺血再灌注損傷時心肌細胞的凋亡水平,進而加重心臟的損傷程度.相反,激活sigma-1受體則可以改善心肌細胞的凋亡水平,減少心臟的損傷.從已有研究中可知,通過激動劑SA4503激活sigma-1受體后,線粒體鈣離子通道的激活、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的正常生產為心臟的收縮舒張功能提供了穩定的鈣穩態環境以及充足的能量供給,從而改善了心臟的功能[15,30-31].除此之外,sigma-1受體對于Akt信號通路也有一定的激活作用,而這也是一條控制細胞凋亡、自噬、生長的經典信號通路[18].