RF-LAMP技術檢測肉制品中沙門氏菌的研究

徐 慧，陳發榮，王保娟，王 永，石 磊，陳 洵，常彥磊，時國強，6，張 偉

（1.河北農業大學，河北保定 071001；2.北京艾旗斯德科技有限公司，北京 101102；3.天津市農業質量標準與檢測技術研究所，天津 300232；4.暨南大學食品安全與營養研究院，廣東廣州 510632；5.廣州雙螺旋基因技術有限公司，廣東廣州 510320；6.河北三獅生物科技有限公司，河北石家莊 050011）

沙門氏菌（Salmonella） 是一種常見的食源性致病菌，屬腸桿菌科、革蘭氏陰性腸道桿菌[1]，主要寄生于人類和動物腸道中，可致食物中毒、慢性腸炎、腸熱癥等[2]。因沙門氏菌經常存活于肉制品、蛋類、水產品中，在20℃以上即能大量繁殖，世界各國普遍規定食品中不得檢出沙門氏菌[3]。根據數據統計，人攝入含有一定量沙門氏菌（1×106～1×107CFU/g）的動物性產品后易引發細菌性感染，我國每年細菌性食物中毒中70%～80%是由沙門氏菌引起的[4-5]。

目前，常用的沙門氏菌檢測方法有傳統方法如國家標準、AOAC等，以免疫學為基礎的檢測方法如酶聯免疫法（ELISA）等，以分子生物學為基礎的檢測方法如聚合酶鏈式反應（PCR） 等[6]。傳統方法培養時間較長，一般需要3～4 d檢測時間[7]。ELISA方法從樣品的制備到檢測結束大概要40～48 h才能完成，且由于使用的多價血清存在不同程度的交叉反應，容易產生假陽性[8]。PCR方法需要昂貴的PCR儀器和繁瑣的電泳，故不宜普遍推廣。因此，亟需開發一種快速檢測食品中沙門氏菌的檢測方法，對于保障我國食品安全具有重要意義。

研究在環介導等溫擴增法（LAMP）[9]基礎上，結合熒光染料SYBR Green I建立的一種實時熒光LAMP（RF-LAMP）技術，為實現沙門氏菌的快速檢測提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

試驗所用菌株包括甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、單增李斯特氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、普通變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌、福氏志賀氏菌、宋內氏志賀氏菌、大腸桿菌O157∶H7、產氣莢膜桿菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌。

1.1.2 樣品

肉制品，購自保定市某超市。

1.1.3 主要培養基和試劑

營養肉湯和營養瓊脂，北京陸橋技術股份有限公司提供；Bst DNA聚合酶、MgCl2和dNTPs，大連寶生物工程有限公司提供；熒光試劑，Sigma公司提供；實時熒光LAMP內、外引物，合成于大連寶生物工程有限公司；DNA提取試劑盒，北京全式金生物技術有限公司提供。

1.1.4 主要儀器

WH-861型旋渦混合器，太倉市科教器材廠產品；數顯超級恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司產品；QYC-200型全溫搖床，上海新苗醫療器械制造有限公司產品；實時熒光監測儀，德國ESE Gmbh公司產品；TGL-16G型離心機，上海安亭科學儀器廠產品。

1.2 方法

1.2.1 純菌的培養

取保藏的菌株接種于滅菌的NB液體培養基中，于37℃條件下振蕩培養過夜。

1.2.2 DNA模板的制備

研究采用熱裂解法進行DNA模板的提取。取過夜培養的菌懸液1.5 mL于滅菌離心管中，以轉速11 000 r/min離心1 min，棄去上清液。加入300 μL無菌蒸餾水洗滌菌體沉淀，重復2次，然后加入100 μL無菌蒸餾水，使菌體充分振蕩懸??；在沸水浴中將菌懸液煮沸10 min，然后以轉速11 000 r/min離心1 min，將上清液轉移至另一新的滅菌離心管中，于-20℃條件下保存備用。

1.2.3 引物設計

研究選取Genebank中已經公布的沙門氏菌inv基因作為靶基因。

實時熒光LAMP所用引物見表1。

表1 實時熒光LAMP所用引物

1.2.4 RF-LAMP反應體系

總反應體系 （25 μL） 包括 2.5 μL 10×Bst buffer，1 μL鎂離子（50 mmol），5 μLdNTPs（2.5 mmol）混合物，1 μLBst酶（8 000 U/mL），1 μL甜菜堿（5 mol），1.5 μL 模板 DNA，0.5 μL SYBR，FIP 和 BIP 引物（10 mmol）各2.5 μL，F3和B3引物（10 mmol）各0.5 μL，無菌雙蒸水補足體積至 25 μL。擴增反應條件為61℃條件下反應1 h。

1.2.5 RF-LAMP的特異性

采用熱裂解法對表1中15株菌進行基因組DNA提取。陰性對照用無菌蒸餾水代替模板。按照優化好的RF-LAMP反應體系進行擴增來驗證該方法的特異性。

1.2.6 RF-LAMP檢測純菌的靈敏度

以編號為CMCC 50041的腸炎沙門氏菌作為試驗菌種進行靈敏度和檢出限的檢測。將過夜培養的新鮮菌液進行平板菌落計數，測得菌液濃度為5.6×109CFU/mL。用無菌生理鹽水對其進行10倍梯度稀釋，得到連續稀釋的腸炎沙門氏菌懸液。取1 mL各稀釋梯度的菌懸液提取基因組DNA，并進行RFLAMP方法的靈敏度試驗。

1.2.7 RF-LAMP檢測人工污染肉制品的檢出限

取25 g經國標法檢測無沙門氏菌的肉制品加入到225 mL的無菌生理鹽水中，制成勻漿液，取9 mL加到離心管（10 mL） 中，分別將10倍梯度稀釋的菌懸液（5.1×107～5.1×102CFU/mL） 各1 mL加到上述離心管中，混勻，得到不同濃度的菌液勻漿。用1.2.2中所述熱裂解法提取基因組DNA，并用RF-LAMP方法驗證人工污染肉制品中沙門氏菌的檢出限。

2 結果與分析

2.1 RF-LAMP的特異性

實時熒光LAMP引物特異性的檢測結果見表2。

從表2中可以看出，用于RF-LAMP特異性試驗的15株試驗菌株中，4株沙門氏菌檢測結果為陽性；其他11株非沙門氏菌檢測結果為陰性，結果表明該研究建立的方法特異性強。

表2 實時熒光LAMP引物特異性的檢測結果

2.2 RF-LAMP檢測純菌的靈敏度

實時熒光LAMP檢測沙門氏菌的靈敏度見圖1。

圖1 實時熒光LAMP檢測沙門氏菌的靈敏度

由圖1可以看出，當沙門氏菌純培養物濃度為5.6×105CFU/mL～5.6×101CFU/mL時，熒光曲線出現明顯的擴增峰，儀器自動判定為陽性；當濃度為5.6×100CFU/mL時，熒光曲線平緩，未出現擴增峰，判定為陰性。因此，研究所建立RF-LAMP檢測沙門氏菌的靈敏度為56 CFU/mL。

2.3 RF-LAMP檢測人工污染肉制品的檢出限

實時熒光LAMP法人工污染肉制品檢出限的確定見圖2。

從圖2中可以看出，當沙門氏菌純培養物濃度為5.6×107CFU/g～5.6×104CFU/g時，熒光曲線出現明顯的擴增峰，儀器自動判定為陽性；當培養物濃度為5.6×103CFU/g時，熒光曲線平緩，未出現擴增峰，判定為陰性。因此，研究所建立RF-LAMP檢測人工污染肉制品的檢出限為5.6×104CFU/g。

圖2 實時熒光LAMP法人工污染肉制品檢出限的確定

3 結論

研究建立了一種RF-LAMP方法來快速檢測沙門氏菌，檢測靈敏度為56 CFU/mL，檢測人工污染肉制品中沙門氏菌的檢出限為5.6×104CFU/g。該方法是在LAMP技術的基礎上，向體系中添加熒光染料，通過觀察是否有峰圖出現就可知道反應是否發生。與PCR方法相比，RF-LAMP可在等溫條件下完成擴增，不需要昂貴的PCR儀；與傳統LAMP相比，該方法的靈敏度更高，且避免了傳統LAMP產生的氣溶膠污染。該方法在結果出現后可直接終止反應，既節省時間又降低了試驗成本，同時避免了繁瑣的電泳?？傊撗芯拷⒌腞F-LAMP檢測沙門氏菌方法特異性強、靈敏度高，為沙門氏菌的快速檢測開辟了新途徑，適合在基層檢測機構推廣應用。