淺談目前豬非洲豬瘟病毒的常用診斷方法

尹訓強

（廣東溫氏大華農生物科技有限公司，廣東 云浮 527400）

距我國首次報道非洲豬瘟病毒（ASFV）感染病例已經一周年了，一年內該病毒幾乎肆虐了國土全境，隨之造成了生豬存欄量銳減、豬肉價格發生猛漲的情況。近期候選疫苗出現、非洲豬瘟弱毒疫苗專利申請成功，據報道中國有關權威部門公布的首例非洲豬瘟流行毒株（SY18）為親本構建的多基因家族（MGF）基因和CD2v 基因缺失的非洲豬瘟病毒基因缺失疫苗候選株[1]和中國流行非洲豬瘟毒株Pig/CN/HLJ/2018 缺失的MGF360-505R 缺失和CD2v 與MGF360-505R 聯合缺失的基因缺失病毒[2]，均顯示出可作為安全和有效的防控中國非洲豬瘟的疫苗的卓越潛能，具有極大的社會價值和國際意義。僅靠撲殺等成本巨大的非洲豬瘟凈化手段，不符合我國生豬飼養量巨大的國情，借鑒已有的多種病毒病共存的防控經驗，研制出有效、安全的防控非洲豬瘟疫苗是目前最為有效和經濟的方法。隨著非洲豬瘟流行病學、相關致病機制、防治疫苗研發、檢測手段等相關領域研究工作的加快，以及未來中國生豬養殖常態化免疫非洲豬瘟疫苗的極大可能，針對非洲豬瘟病毒的臨床診斷技術和快速診斷檢測技術產品的使用，始終會伴隨著各個防控非洲豬瘟和生豬養殖的各個環節。

1 臨床早期表現及診斷

基層獸醫的專業性水平決定著臨床早期診斷ASFV 的成敗，獸醫從業者面對該病更要在診斷環節中加強學習和總結，進而不斷提高對該病的臨床診斷技術。

1.1 三種毒力類型ASFV 在臨床上的不同表現[3]

不同類型的ASFV 的主要臨床表現和剖檢病變的指標包括以下方面：精神狀態、體征變化、凝血不良的現象、皮膚、淋巴結、心、肝、脾、肺、腎、膽囊、扁桃體、繁殖性能變化等。

強毒株可引起最急性型（感染后1 ～4 d 死亡）和急性型（感染后3 ～8 d 死亡）臨床表現。發病豬體溫可達41 ～42 ℃，嘔吐、血便、食欲廢絕、精神沉郁、呼吸困難，皮膚充血變紅或變藍色，豬只有時無征兆發生猝死，發病率和死亡率可達100%。

中等毒力毒株可引起感染20 d后死亡的亞急性型表現，死亡率略低，打針流血不止。主要癥狀是比急性型更為強烈的出血和水腫，死亡率為30% ～70%。耐過豬約3 ～4周后康復后成為帶毒豬。

強毒力、中等毒力毒株是以發熱和網狀內皮組織出血為特征[4]，均可使妊娠母豬流產，胎兒全身水腫，胎盤、皮膚、心肌或肝臟可見淤血點。

低毒力毒株引起慢性型的特征是病豬無出血表現，耳部、腹部和大腿內側等部位皮膚可見壞死、局部紅斑或凸起，康復后成為病毒攜帶者。

1.2 病理變化

最急性型發病豬急性死亡，其內臟組織器官的肉眼病變不明顯。

急性型病豬，脾充血性腫大約3 ～6 倍，邊緣腫脹、質脆、外觀黑紫色；胃、肝和腎等部位的淋巴結出血、腫大，質地變脆；腎臟皮質和腎盂通常出現瘀血點。病豬因肺水腫嚴重而死亡；胃底部淤血，膽囊充盈。其他非典型病理變化還包括膀胱、心內膜、心外膜和胸膜有出血點。發生腹瀉或血便的病豬可見出血性腸炎。

亞急性型豬只呈現腹水、心包積液、膽囊和膽管壁的特征性水腫以及腎周邊水腫。脾臟起初表現為出血性腫大，逐漸轉歸；淋巴結呈現出血、水腫和易碎，呈現為深紅色血腫，主要是在胃和腎的淋巴結，以及頜下腺、咽后、縱膈、腸系膜和腹股溝淋巴結。腎臟（皮質、髓質和腎盂）出血比急性型更嚴重和廣泛。

慢性非洲豬瘟的病變特點表現為肺部局部肉芽腫，形成結節或肺臟肉樣實變、纖維素性胸膜炎、干酪樣肺炎和淋巴網狀組織增生；也常見纖維素性心包炎和壞死性皮膚病變；扁桃體和舌上可見壞死。

2 實驗室診斷方法

2.1 病原學診斷

聚合酶鏈式反應（PCR）分為普通PCR 和實時熒光定量PCR 兩種。目前學術界研究的PCR 引物一般都是以靶向病毒基因組高度保守區域P72（P73）、P54 等蛋白基因[5-7] 設計，具有較高特異性和敏感性，適合各類ASFV 毒株的檢測。

世界動物衛生組織（OIE）推薦采用PCR 和實時熒光定量PCR方法，可以直接從采樣組織和體液中檢測病毒，具有良好的特異性[8]。相對來講，直接免疫熒光試驗主要用于檢測實質臟器（脾臟、肺臟、淋巴結和腎臟）等組織觸片或冷凍切片中的病毒抗原，該方法快速、經濟和敏感性高，但對于非洲豬瘟的亞急性或慢性病例，若組織中已形成了抗原- 抗體復合物，那么該方法的敏感性會下降到40% ；血細胞吸附試驗的原理是，紅細胞能吸附在體外培養的感染ASFV 的巨噬細胞膜表面，因此，將病料組織感染巨噬細胞后，紅細胞如果在巨噬細胞周圍形成典型的玫瑰花環，則證明該病料組織中含有ASFV。該方法特異性和敏感性均較高，但有些非洲豬瘟病毒毒株能迅速誘導巨噬細胞產生細胞病變，而不出現血細胞吸附現象。

此外，也有人采用非結構蛋白DNA 聚合酶G1211R 基因的實時熒光環介導等溫擴增（LAMP）方法，用于大量樣品的快速檢測。研發ASFV 熒光PCR 檢測試劑盒，可以避免由于操作環境、試劑不同和人為操作水平參差不齊等原因而影響該方法對ASFV 的檢測效果。

2.2 血清學診斷

檢測抗體可用于ASFV 感染豬的診斷，目前常用的有間接免疫熒光試驗（IFA）、間接酶聯免疫吸附試驗（ELISA）等，并且OIE 將ELISA 作為診斷ASFV 的首選血清型方法。最急性和急性病例的豬死亡率高，通常血清抗體轉陽前即會死亡。亞急性病豬耐過或康復后可產生高水平的ASFV 特異性抗體。一般病毒感染后4 d 可產生IgM 抗體，感染后6 ～8 d 產生IgG 抗體。抗體與ASFV 可同時存在于感染豬血液，大約持續6 個月，有時病毒可存在數年。

ELISA 檢測法是一種靈敏的、廉價的方法，可大批量檢測血清。但該法不足之處就是常有假陰性或假陽性結果的出現，這主要是因血清的保存不當及缺少特異性抗體而引起的[9]。

3 討論

3.1 對ASF 的臨床診斷必須及時和準確

“早、快、嚴、小” 是傳染病處理原則，要求基層防疫過程中，對病原體要早排查、早發現、早上報、早診斷！只有及時診斷出來結果，才會避免大面積污染環境，然后立即采樣、上報、必須在國家指定的實驗室檢測疑似病豬。

與ASFV 感染相關的臨床特征具有高度的可變性，這取決于多種因素：病毒致病力、豬的品種、暴露途徑、感染劑量和該地區的非洲豬瘟流行狀況。因為國內研究條件要求的嚴格性、基層豬場總結臨床癥狀的專業性缺乏等原因，造成很少報道中國豬場感染病毒及病毒致病能力大小的文章，從而對本國毒株及其致病性能的研究缺乏臨床詳細的資料。

目前已發現，在疫病流行區（在中、強毒株傳播的同時）存在低毒力的毒株，非洲豬瘟潛伏期可達4 ～19 d，如此較長的潛伏期可以帶來很大的影響，對于國際上廣泛采用的早期定點精準清除病豬措施來講，直接決定了其成功與否和是否能干凈處理。也是追溯感染最初時間的重要依據。

病理剖檢一般不建議進行，哪怕是疑似。因為豬場在解剖過程中，出現任何不嚴密的操作和處理措施，很容易造成ASFV 的散播，進而加重了生物安全防控工作。

ASFV 對于豬瘟、豬丹毒、豬繁殖與呼吸綜合征、豬皮炎腎病綜合征、中毒等病的鑒別診斷也同樣重要，驚恐之下，沒有診斷經驗的獸醫往往誤診，造成的眾多無辜病豬被人為地撲殺！要借助流行病學特征進行排除，如是否使用餐廚廢棄物飼喂豬、與售豬商販接觸、引入了來自疫區的感染豬、接觸了來自疫區的相關人員及豬肉制品等。在非洲豬瘟和其他病沒有出現明顯區別的臨床癥狀之前，最終還是要以權威實驗室的確診結果為主。

3.2 實驗室診斷方法是最有效的手段

實驗室診斷方法是目前對于研究非洲豬瘟病毒相關生化指標數據的最有效的手段。

目前非洲豬瘟病毒格魯吉亞2007/1 毒株對家豬傳播的動力學機理的研究發現，通過病毒滴定法和實時定量PCR(qPCR) 法檢測ASF病毒，利用血清學試驗測定ASF 病毒特異性抗體，試驗結果顯示，接種感染豬第3 天可在其血液中分離到有傳染性的ASF 病毒，而通過直接接觸和間接接觸進行感染的豬分別在暴露后第10 天和第13 天方可從血液中分離到有傳染性的ASF 病毒，ASF 臨床癥狀發生時，ASF 病毒在血液中的滴度高于在鼻液和腸液中的，口液樣本中沒有分離到有傳染性的ASF 病毒而檢測到了其病毒的基因組[10]。

3.3 唾液檢測對前期檢測的研究價值

通過采集健康、 疑似、 患病豬只的唾液，對檢測ASFV 的敏感性、可靠性的研究，褒貶不一，還有待深入。有人研究得出，唾液及鼻腔黏液比血液中病毒檢出時間提早2~5 d，直腸黏液比血液中病毒檢出的時間雖然滯后，但其病毒載量更高，血液中病毒載量是唾液中病毒載量的1 萬倍，唾液比血液中病毒檢出時間提早3 d 以上。對檢測方法的靈敏度要求較高，唾液中含有DNA 酶和蛋白酶，可降解核酸的蛋白和DNA 的含量、不及時冷凍或運輸中解凍，核酸均可被降解，因此唾液采集的方法的規范性很重要。相對而言，鼻腔黏液受到的干擾因素較小。精液中也存在著影響PCR 反應的因素，需使用柱提法提取核酸。

另外，采集的病料的風險因素的評估要求，唾液收集過程中，要避免病毒的擴散。

3.4 實驗室診斷要求采樣和實驗室操作程序要準確。

病毒感染潛伏期往往在組織和體液中是不一樣的，ASFV 往往先攻擊的是巨噬細胞和單核細胞，此時扁桃體、唾液中可能會率先呈現出大量的病毒復制，所以前期采樣需要把重點放在這里。采樣往往因為這些環節微小的錯誤，就會影響有效檢出病毒量的結果。

核酸的快速的有效提取，很大程度上影響著檢測時間的長度。目前利用裂解酶免提取方法，大大節約了提取時間，可以在15 ～35 min內完成檢測。

另外，提取核酸或者擴增產物等過程中，操作不當造成DNA 氣溶膠污染整個實驗室環境，往往使得檢測結果一直是陽性，這個時候就要借助一些生物試劑或者物理措施進行反復處理，確保解除污染后再進行正常操作。

3.5 ASFV 檢測試劑盒的行業質量標準，仍需要進行大量后期工作。

按照國家藥品監督管理局第35號令《新生物制品審批辦法》的有關要求，對產品進行長期的穩定性考核，考察最敏感質量指標（最低檢出量和重復性），考核時間以產品的保質期時間跨度為標準。在 “以科學研究為基礎、質量監控體系為保障” 的前提下，國家已經公布了研發生產出的一批高質量的ASFV熒光PCR 檢測試劑盒，實現了快速定量檢測。隨著越來越多檢測試劑盒的誕生，一定要建立試劑盒質量要求和監控體系，即針對合成的引物、探針、陰陽性對照品等部分，建立完善的質量檢驗方法，保證試劑盒使用質量，更好地服務獸醫診斷工作。