芽囊原蟲致病機制的研究進展

芽囊原蟲(Blastocystis)是一種無運動細胞器的厭氧原蟲，常寄居于人類和動物的腸道。該蟲曾先后被認為是鞭毛蟲的包囊、植物、酵母菌及真菌等，最終被歸為不等鞭毛類生物(Stramenopiles)。芽囊原蟲生活史中的形態(tài)多樣，文獻中報道有4種類型，分別是空泡型、顆粒型、包囊型及阿米巴型，其中空泡型最常見，典型特征是中央含有一個約占90%細胞總體積的空泡[1]。基于SSU-rDNA測序，現(xiàn)已報道的芽囊原蟲包含17個亞型(subtype, ST)[2]，已在人類糞便中發(fā)現(xiàn)9個亞型(ST1-ST9)，其中ST1-ST4更為普遍，而在大多數(shù)人類流行病學研究中發(fā)現(xiàn)的最常見的是ST3，其次是ST1[3-6]。芽囊原蟲感染呈世界性分布，并具有廣泛的地理差異性。歐洲地區(qū)最常見的是ST3，其次是ST4、ST1，其他地區(qū)最常見的是ST3、其次是 ST1、ST2[7]，我國最常見的是ST3。從已公布的數(shù)據(jù)推斷全球約有1～2億人感染該蟲[8]，發(fā)達國家的感染率約為0.5%～23%，由于衛(wèi)生條件差、水和食物被污染等原因，發(fā)展中國家的芽囊原蟲感染率高達27%～76%，當前我國的感染率約為0.1%～32.6%[9]。芽囊原蟲感染相關(guān)的臨床癥狀主要是腹痛、腹瀉以及一些非特異性的胃腸道癥狀如惡心、嘔吐等[10-11]。臨床調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)芽囊原蟲感染與腸易激綜合征(irritable bowel syndrome, IBS)、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)有關(guān)[12-15]。研究表明芽囊原蟲通過糞-口傳播，主要寄居部位是盲腸和結(jié)腸，且芽囊原蟲感染能引起促炎細胞因子IFN-γ、IL-12和TNF-α上調(diào)及不同程度的腸道病理變化。但該蟲的具體致病機制尚不明確。近年來許多學者通過體外研究提出了幾種芽囊原蟲的致病機制，包括降解緊密連接蛋白引起腸上皮細胞通透性增加、細胞凋亡、上調(diào)腸道上皮細胞內(nèi)的促炎細胞因子以及下調(diào)誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)。本文就芽囊原蟲致病機制的最新研究進行綜述。

1 體內(nèi)研究

1.1傳播 Yoshikawa等發(fā)現(xiàn)從實驗室大鼠糞便中分離的RN94-9蟲株能夠通過口服感染大鼠，表明芽囊原蟲的傳播途徑為糞-口傳播，該研究還證實了包囊是該寄生蟲唯一的傳播階段[16]， Moe等人還認為小鼠感染芽囊原蟲具有年齡相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)8周齡成年BALB/c小鼠不感染芽囊原蟲，而幼年BALB/c小鼠(<3周齡)比成年小鼠更易感，并且芽囊原蟲在免疫功能正常的小鼠中引起的感染具有自限性[17]。張紅衛(wèi)等人發(fā)現(xiàn)免疫抑制劑組小鼠比非免疫抑制劑組的腸黏膜超微結(jié)構(gòu)病變更加嚴重，且小鼠糞便和腸道中的芽囊原蟲蟲體數(shù)量更多，表明芽囊原蟲感染與宿主的免疫狀況有關(guān)[18]。姚繁榮等人還發(fā)現(xiàn)芽囊原蟲感染的持續(xù)時間與感染的蟲體數(shù)量有關(guān)，且免疫功能低下的小鼠帶蟲感染持續(xù)時間明顯長于免疫功能正常小鼠[19]。這些研究表明通過使用免疫抑制藥物能增加芽囊原蟲感染發(fā)病的嚴重程度，成功建立該病小鼠模型。

1.2寄居部位 Fayer等對自然感染芽囊原蟲的豬進行研究后發(fā)現(xiàn)，在其空腸、結(jié)腸及盲腸的組織切片中觀察到芽囊原蟲，而在十二指腸或回腸中沒有檢測到。大多數(shù)情況下，在盲腸中發(fā)現(xiàn)的芽囊原蟲為空泡型和顆粒型，而在結(jié)腸中僅發(fā)現(xiàn)包囊型。在盲腸中，芽囊原蟲主要存在于管腔內(nèi)容物中，組織切片顯示芽囊原蟲粘附于腸上皮，但在上皮層或固有層內(nèi)均未觀察到芽囊原蟲[20]。姚繁榮等人發(fā)現(xiàn)經(jīng)口感染的小鼠胃內(nèi)有大量芽囊原蟲寄生，且經(jīng)直腸感染的小鼠的上消化道內(nèi)均有蟲體寄生，推測芽囊原蟲可能以阿米巴樣運動方式從直腸向上消化道運動，該研究提示芽囊原蟲的寄居部位可能比以往報道的腸道范圍更廣[19]。Wang等發(fā)現(xiàn)芽囊原蟲易定植于免疫功能受損的豬小腸中，表明宿主的免疫狀況或腸道環(huán)境可能影響芽囊原蟲的定植[21]。但芽囊原蟲能否侵襲腸道一直存在疑問，并沒有能證明該蟲侵襲的實質(zhì)證據(jù)。已有研究顯示線蟲在通過皮膚和腸道時會分泌透明質(zhì)酸酶(水解透明質(zhì)酸，促進組織液滲透)，Chandramathi等發(fā)現(xiàn)感染芽囊原蟲的大鼠尿液中的透明質(zhì)酸酶水平較感染前顯著升高，表明該蟲能夠在宿主的腸道組織中具有侵入或穿透活性，提供了人芽囊原蟲能侵襲結(jié)腸上皮的間接證據(jù)[22]。Elwakil等發(fā)現(xiàn)，感染高劑量芽囊原蟲(4×107個)小鼠的盲腸的組織切片顯示空泡型人芽囊原蟲浸潤固有層、粘膜下層和肌層，且肌層有空泡型芽囊原蟲聚集[23]。Li等研究顯示，ST1芽囊原蟲滋養(yǎng)體能侵入SD大鼠的腸道固有層[24]，但是這一結(jié)果具有個體差異性。故推測芽囊原蟲究竟是否具有侵襲性可能與它的毒力及宿主免疫狀況有很大相關(guān)性。

1.3腸道組織變化 由于芽囊原蟲最容易寄居的部位是盲腸和結(jié)腸，一些學者就針對該部位進行了組織學研究。感染芽囊原蟲的小鼠盲腸和結(jié)腸的組織學檢查顯示固有層充血水腫、腺體結(jié)構(gòu)不完整、黏膜下層不同程度的炎癥細胞浸潤、粘膜上皮脫落偶見壞死，并且遠端結(jié)腸是病理改變最嚴重的部位[17-19]。還有研究認為炎癥的嚴重程度與感染的劑量和亞型有關(guān)。Hussein等評估了感染不同亞型芽囊原蟲的大鼠的病理生理變化、腸組織病理狀態(tài)和腸上皮通透性，發(fā)現(xiàn)所有無癥狀的亞型(ST2和ST4)僅誘導輕度感染，而ST1蟲株和大多數(shù)ST3蟲株誘導的腸道病理變化更為嚴重[25]。Iguchi等對感染ST4芽囊原蟲的大鼠進行腸組織學檢測發(fā)現(xiàn)既沒有粘膜浸潤也沒有炎癥細胞浸潤，但在感染1～3周后，盲腸粘膜中杯狀細胞數(shù)量增加。此外，大鼠在感染2-3周后，盲腸粘膜中促炎細胞因子IFN-γ、IL-12和TNF-α的表達顯著上調(diào)，而上皮緊密連接蛋白和閉合蛋白的表達沒有顯著變化，表明盲腸上皮的結(jié)構(gòu)完整性沒有受到嚴重的影響[26]。Yan等發(fā)現(xiàn)在無癥狀患者中僅檢測到ST2蟲株，而在有癥狀患者中最常見的是ST1蟲株[27]。這些研究表明腸道癥狀與感染的芽囊原蟲亞型的致病性有關(guān)。

以上這些研究通過盲腸內(nèi)接種芽囊原蟲滋養(yǎng)體或包囊灌胃的方式建立了芽囊原蟲感染動物模型并確定了芽囊原蟲的傳播途徑、寄居部位以及可能引起的腸道病理變化，但目前沒有任何一項研究能夠滿足科赫法則[28](用來確定侵害性病原物的操作程序，包括4個步驟：I. 在每一病例中都出現(xiàn)相同的微生物，且在健康者體內(nèi)不存在；Ⅱ. 要從宿主分離出這樣的微生物并在培養(yǎng)基中得到純培養(yǎng)；Ⅲ. 用這種微生物的純培養(yǎng)接種健康而敏感的宿主，同樣的疾病會重復發(fā)生；Ⅳ. 從試驗發(fā)病的宿主中能再度分離培養(yǎng)出這種微生物)。因此，需要建立合適的動物模型以進行下一步研究。

2 體外研究

2.1腸道通透性增加 Mirza等將ST7芽囊原蟲活蟲體及其裂解液在與Caco-2細胞(人結(jié)腸腺癌上皮細胞)共培養(yǎng)后，蟲株的半胱氨酸蛋白酶誘導Rho激酶/肌球蛋白輕鏈磷酸化導致緊密連接蛋白ZO-1降解和F-肌動蛋白重組，使腸道上皮通透性增加[29]。Puthia等發(fā)現(xiàn)ST4芽囊原蟲能夠使IEC-6細胞(大鼠小腸隱窩上皮細胞)F-肌動蛋白重組、降低跨膜電阻，從而增加腸上皮通透性[30]。Wu等研究發(fā)現(xiàn)，ST7和ST4芽囊原蟲降解Caco-2細胞緊密連接蛋白具有差異性，前者能通過降解緊密連接蛋白ZO-1誘導破壞上皮屏障，導致上皮細胞通透性增加，但后者對腸道上皮的作用卻微乎其微。該研究還發(fā)現(xiàn)兩個ST4蟲株(WR-1和 S-1)與腸道的粘附程度可忽略，而ST7亞型蟲株(ST7-H)相較于其它ST7蟲株與宿主上皮細胞的粘附程度最大，并能最大程度地誘導上皮通透性增加，表明蟲株與宿主細胞的粘附程度與誘導通透性增加相關(guān)，并且亞型間和亞型內(nèi)均存在差異性[31]。還有研究發(fā)現(xiàn)腸上皮細胞表面的半乳糖能防止ST7-H粘附腸上皮，從而抑制緊密連接蛋白ZO-1降解，表明蟲株與半乳糖殘基的結(jié)合在早期腸道屏障的損害中起著重要作用[32-33]。

2.2細胞凋亡 Puthia等發(fā)現(xiàn)在與ST4芽囊原蟲活蟲體及其裂解液共培養(yǎng)的IEC-6細胞中，凋亡細胞百分比分別比對照組顯著增加了4倍和7倍，且實驗組的IEC-6細胞中半胱天冬酶3(Caspase-3)的活性顯著增加。該研究首次證明了芽囊原蟲能誘導細胞凋亡[30]。Wu等發(fā)現(xiàn)人源性ST7蟲株能誘導Caco-2細胞凋亡，而大鼠源性ST4蟲株則無此類作用，表明芽囊原蟲感染具有宿主特異性[31]。

2.3免疫調(diào)節(jié) 寄生蟲的半胱氨酸蛋白酶在宿主細胞的侵入、免疫逃逸和毒力中起著重要作用。ST7和ST4芽囊原蟲均具有半胱氨酸蛋白酶活性，能降解人分泌型IgA(sIgA)，促進芽囊原蟲在體內(nèi)存活，并且ST7蟲株的半胱氨酸蛋白酶活性比ST4蟲株高約兩倍，提示芽囊原蟲的半胱氨酸蛋白酶活性存在亞型間差異[3,34]。Mirza等研究發(fā)現(xiàn)，分別將ST7和ST4芽囊原蟲與Caco-2細胞共培養(yǎng)后，Caco-2細胞通過表達iNOS(L-精氨酸轉(zhuǎn)化為NO的限速酶)產(chǎn)生一氧化氮(NO)啟動防御機制。結(jié)果ST7蟲株下調(diào)iNOS的表達抑制NO的產(chǎn)生，但ST4蟲株無此作用。該研究還發(fā)現(xiàn)ST7蟲株的精氨酸酶活性比ST4蟲株更高，可能有助于ST7蟲株逃避宿主的NO防御反應[35]。

芽囊原蟲能上調(diào)促炎細胞因子的表達。Puthia等發(fā)現(xiàn)ST4蟲株活蟲體及其裂解液的半胱氨酸蛋白酶誘導T84細胞(人結(jié)腸癌細胞)中的IL-8上調(diào)，且這種上調(diào)是由NF-κB介導的[36]。伍玲園等人的研究顯示小鼠感染芽囊原蟲能促進促炎細胞因子IL-17和IL-23高表達，從而誘導腸道炎癥的發(fā)生[37]。Mei等人發(fā)現(xiàn)ST7和ST4芽囊原蟲活蟲體及其裂解液產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶能誘導小鼠巨噬細胞絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶活化，上調(diào)促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達[38]。Long等發(fā)現(xiàn)將ST1蟲株與T84細胞和HT-29細胞(人結(jié)腸癌細胞)共培養(yǎng)24小時后能誘導IL-8和GM-CSF上調(diào)[39]。

綜上，通過對腸上皮細胞與芽囊原蟲蟲體及蟲體裂解液共培養(yǎng)進行研究后提出了芽囊原蟲的幾種致病機制[40]，包括通過降解緊密連接蛋白導致腸上皮細胞通透性增加、細胞凋亡、誘導腸道上皮細胞內(nèi)的促炎細胞因子表達上調(diào)以及下調(diào)iNOS。Wawrzyniak等從一株ST7蟲株的培養(yǎng)上清液中純化并鑒定了2個半胱氨酸蛋白酶，即18 kDa的組織蛋白酶B(cathepsin B)和位于細胞表面的31 kDa的豆莢蛋白酶(legumain)。推測它們可能是芽囊原蟲潛在的毒力因子[41]。Wu等的研究還表明，上述legumain可能對芽囊原蟲的生存有促進作用[31]。Puthia等的研究結(jié)果首次表明中央空泡可能作為半胱氨酸蛋白酶的儲庫[36]，這就可以解釋為什么在一些研究中發(fā)現(xiàn)蟲體裂解液比活蟲體對宿主產(chǎn)生的影響更為嚴重。

3 結(jié)論與展望

體內(nèi)外實驗研究芽囊原蟲對腸道的影響，該蟲既能定植于腸腔表面并能粘附腸上皮又能逃避宿主免疫反應，還能降解緊密連接蛋白ZO-1、誘導細胞凋亡和增加腸道通透性，并且鑒定了2種潛在的毒力因子。芽囊原蟲還具有免疫調(diào)節(jié)作用，包括降解IgA、抑制iNOS、上調(diào)腸上皮細胞內(nèi)的促炎細胞因子IL-8和GM-CSF以及小鼠巨噬細胞的IL-1β、IL-6和TNF-α，這些研究均表明了芽囊原蟲的致病潛力，但其致病性仍然存在爭議，目前沒有實驗滿足科赫法則，因此需要建立合適的動物模型來研究芽囊原蟲與宿主間的相互作用。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，腸道疾病往往與腸道菌群失調(diào)有很大相關(guān)性，菌群失調(diào)也有可能是造成腸道疾病的一個重要因素。Casén等研究發(fā)現(xiàn)，80%的緩解期IBD患者和73%的IBS患者存在腸道菌群失調(diào)，而健康人群僅有16%[42]。Nourrisson等研究發(fā)現(xiàn)芽囊原蟲感染能引起人腸道內(nèi)雙歧桿菌屬(Bifidobacteriumspp)和普拉梭菌屬(Faecalibacteriumprausnitzii)的含量降低[43]，而這兩種細菌有抗腸道炎癥的作用[44],該研究首次表明芽囊原蟲能引起腸道菌群的改變。Yamamoto等研究發(fā)現(xiàn)芽囊原蟲是克羅恩病(屬于IBD的一種)患者最常感染的寄生蟲，并且該蟲還能導致疾病復發(fā)[45]，但是否由于感染芽囊原蟲引起這兩種細菌減少使得疾病復發(fā)目前尚不明確。Audebert等的研究顯示，與無芽囊原蟲感染者相比，芽囊原蟲感染患者的腸道具有更高的細菌多樣性。此外，芽囊原蟲感染患者在綱(Class)的級別上具有更高豐度的梭狀芽胞桿菌(Clostridia)，在科(Family)的級別上具有更高豐度的瘤胃球菌(Ruminococcaceae)和普雷沃氏菌(Prevotellaceae)(這3種細菌有助于維持腸道穩(wěn)態(tài))，而腸桿菌(Enterobacteriaceae)在未感染芽囊原蟲人群中更豐富，故推測芽囊原蟲感染并不與通常在代謝性或感染性腸道疾病以及下消化道炎癥造成的腸道菌群失調(diào)相關(guān)，而是與健康的腸道菌群相關(guān)[46-47]。這些研究提示我們，芽囊原蟲感染在一定程度上可能有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用，但芽囊原蟲是否能通過改變腸道菌群來刺激宿主免疫應答目前尚不明確，這是芽囊原蟲未來的一個重要研究方向。

利益沖突：無

本文引用格式：孫沁, 嚴宜明. 芽囊原蟲致病機制的研究進展[J]. 中國人獸共患病學報, 2019,35(4):345-349,354. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2692.2019.00.036