天然藥物保護神經元治療阿爾茨海默病研究新進展?

陳俊宗，江耀飛，洪芬芳，楊樹龍

(1. 南昌大學基礎醫學院生理教研室，南昌 330046； 2. 中山大學附屬第七醫院，廣東 深圳 518107； 3. 武漢大學中南醫院，武漢430061； 4. 南昌大學醫學實驗教學中心，南昌 330046)

阿爾茨海默病(alzheimer disease, AD)是一種神經退行性疾病，源于腦細胞死亡導致記憶喪失和認知能力下降以及日常生活活動的受限[1]。隨著全球老齡化的發展，癡呆成為全世界的主要健康問題。AD是最常見的癡呆類型，患病比例占癡呆患者的60%。眾多研究表明，在AD進展中，大腦中有相當數量的神經元退化和丟失，且有報道指出神經元凋亡可能是AD病理特征重要的組成部分。AD的原因和機制尚不明確，目前仍然沒有有效的治療方法能夠預防、停止或逆轉AD，因此對于患者、家庭及社會來說，尋找可以阻止疾病進展的藥物具有強大的吸引力。有學者近年來觀察到，部分天然藥物可以調節大腦微環境，保護神經元細胞，并促進神經干細胞增殖、分化和遷移，在AD治療基礎研究中具有明確的治療作用[2]。

1 抑制Aβ的神經元毒性

老年斑和神經元纖維纏結是診斷AD的典型病理特征。研究已證實，β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein, Aβ)是構成AD腦中老年斑的主要成分。部分學者認為，Aβ肽斑塊的積累是AD發病的主要因素，也是AD發病的驅動因素[3]。沉積的Aβ誘導大腦異常神經元網絡活性導致AD患者認知缺陷，被認為是阿爾茨海默病(AD)的合理機制之一。作為學習和記憶相關的重要結構，海馬是AD早期容易受損的腦區域之一，并且海馬CA1區域選擇性地易受可溶性Aβ寡聚體影響[4]。

Aβ可激活神經膠質細胞，釋放細胞因子和炎癥遞質并產生炎癥反應，從而損傷神經細胞[5]。已知姜的成分具有緩解AD臨床癥狀的作用。最新發現，姜的主要成分6-姜烯酚在脂多糖(LPS)處理后的星形膠質細胞和LPS誘導的炎癥及短暫性全面缺血的動物模型中，顯示出抗神經炎癥作用。Moon M等進一步研究發現，6-姜烯酚可以顯著增強模型鼠的記憶力，其主要是因為其減少AD小鼠海馬內小膠質細胞激活與星形膠質細胞增生[6]。Park SJ等利用AD大鼠模型發現，乙醇提取物INM-176(當歸標準化乙醇提取物)在體外可以抑制海馬組織中乙酰膽堿酯酶活性，同時減弱海馬中Aβ(1-42)蛋白誘導的星形膠質細胞活化，并減少海馬CA3區和基底核的膽堿能神經元損傷。這些結果表明，INM-176可以通過抑制乙酰膽堿酯酶和保護神經元活性改善AD大鼠的記憶損傷[7]。

功能障礙的線粒體與細胞氧化應激、鈣離子平衡調節、穩定折疊蛋白反應密切相關，并能調控細胞凋亡。Aβ在線粒體膜上沉積導致線粒體外膜形態結構變化與凋亡性電子傳遞鏈氧化磷酸化障礙，啟動細胞內凋亡途徑[8]。Kanno H等在體外原代培養大鼠皮層神經元48 h建立細胞模型，然后使用Aβ寡聚體和藥物處理這些細胞進行對照研究，探究抑肝散對Aβ寡聚體誘導的體外神經毒性的影響。結果表明，抑肝散劑量依賴性抑制Aβ寡聚體誘導的胱天蛋白酶-3的活化與DNA斷裂，減少神經元損傷[9]。Yang L等采用離體腦皮質線粒體進行研究發現，竹堿A可以還原寡聚Aβ(1-42)誘導的ATP，改善線粒體腫脹，降低呼吸鏈復合物酶的活性，逐步恢復神經元細胞的功能，這些效應可歸因于竹堿A阻斷Aβ(1-42)寡聚體穿透進入線粒體[10]。Park H等采用標準魚腥草水提取物(HCW)預處理暴露Aβ(25-35)的神經細胞，發現HCW可以抑制Aβ(25-35)誘導的細胞內鈣水平升高，活性氧物質過量產生、線粒體膜潛在破壞和半胱天冬酶3的活化。這些結果表明，HCW通過鈣的排泄和調節線粒體凋亡途徑對抗Aβ(25-35)誘導的神經毒性[8]。因而學者認為，線粒體障礙導致的細胞能量供應不足與線粒體途徑介導的細胞凋亡程序是AD神經元丟失的重要因素。抑制Aβ神經元毒性與恢復神經元細胞供能為治療AD提供了新的治療策略。

2 改善突觸功能

突觸功能衰竭是認知功能障礙的病理基礎，也成為AD的一種主要標志。隨著AD進展，突觸密度降低，突觸傳遞損害和突觸可塑性缺陷是突觸病理學的標志[11]。AD的臨床處方藥預計只能帶來輕微癥狀改善或延緩其進展，降低Aβ代理改進記憶策略尚未成熟。因而有學者假設通過構建神經元網絡(包括軸突再生和突觸形成)改善認知功能，進而探索根本的抗AD藥物的候選物，從而恢復Aβ誘導的神經萎縮和記憶障礙[12]。基于體外神經萎縮的恢復與體內顯著改善記憶的候選研究，學者發現腦功能恢復可能與AD神經網絡重建相關。

據報道，葛根素在AD的實驗動物模型中具有神經保護作用。Bagheri SM等進一步研究發現，葛根(radix puerariae, RPE)和葛根素單獨促進神經突觸最佳生長濃度分別為1 μg·ml-1和5 μM·ml-1。在該濃度條件下，RPE和葛根素可促進axo樹突狀喬木和突觸形成來營養神經，同時上調許多蛋白質(包括神經發育相關的dynein輕鏈2(DLC2)，延長因子2(EF2)，海馬神經元中的動力蛋白(DLC2和Dync1h1亞基水平)增強突觸，誘導神經元細胞生長[13]。AD動物模型中觀察到的線粒體功能障礙，與海馬神經元細胞過度的氧化應激現象，進一步支持AD患者神經元細胞線粒體缺陷導致突觸障礙這一假說[11]。

3 抑制谷氨酸毒性

谷氨酸(glutamate, Glu)是腦中最常見的興奮性神經遞質，在人的學習記憶過程發揮著重要作用。Glu在突觸前神經元的突觸間隙中釋放，并與突觸后神經元上的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)結合，谷氨酸濃度增加或神經節谷氨酸敏感性增強，使氧化還原穩態失衡，引起谷胱甘肽水平的降低，導致細胞死亡[14]。此外，NMDAR活化后，陽離子通道開放，鈣離子流入突觸后神經元，鈣過量流入導致神經元細胞的凋亡和壞死[15]。

有學者在APP轉基因模型鼠與野生型小鼠的對比研究中發現，野生型組小鼠海馬內神經元的凋亡數量明顯低于基因組小鼠，并推測基因組小鼠谷氨酸表達的降低也可能與神經元的過多凋亡有關[15]。NMDA受體介導的興奮性谷氨酸毒性在淀粉樣蛋白誘導的神經細胞死亡中發揮重要作用。鼻疽根和葉的乙醇提取物以劑量依賴性方式減少谷氨酸和淀粉樣蛋白引起的神經元細胞死亡。研究人員通過測定自由基清除量以及酚、類黃酮和固醇含量來評價氧化活性，發現鼻疽葉中的羽扇豆醇、豆甾醇和β-谷甾醇分子具有抵抗谷氨酸毒性的作用[14]。在化學藥物中，研究顯示吡格列酮可減少NMDA介導的鈣電流和瞬變, 參與谷氨酸能通路，從而改善東莨菪堿誘導的記憶障礙[16]。

4 抑制膠質細胞過度活化

越來越多的證據表明，持續的神經膠質介導的炎癥是AD中觀察到的神經退行性過程和認知缺陷的主要原因。在很多AD 的發病過程中，Aβ是誘導小膠質細胞激活的始動因素。Aβ沉積并與受體相互作用激活小膠質細胞，導致細胞內信號傳導通路的激活，最終使多種促炎因子、活性氧等基因表達。小膠質細胞是AD中的主要免疫活性與吞噬細胞，在神經炎性斑塊和神經纖維纏結形成中起重要作用。研究表明，小膠質細胞介導的炎癥反應是一把“雙刃劍”，執行既有害又有益的功能，過度激活對神經元產生直接或間接的毒性作用。

有學者觀察發現，AD 實驗模型中活化的小膠質細胞數量明顯增多，以海馬部位最明顯。海馬及前腦區域炎癥因子表達增強與大鼠的記憶能力下降以及行為改變，均證實活化的小膠質細胞對神經元的慢性損害作用。星形膠質細胞具有與小膠質細胞物理相互作用的能力，顯著控制其活化、吞噬能力以及分泌炎癥介質，如TNF-α、IL-12的能力。在AD中，小膠質細胞分泌一些炎癥因子激活星型膠質細胞[17]，反過來星形膠質細胞通過分泌炎癥信號分子可改變小膠質細胞的形態特征，從而影響小膠質細胞的吞噬清除功能[18]。在中樞神經系統中，激活小膠質細胞引起的炎癥反應被認為是神經炎癥疾病的重要機制[19]。Wang CC等利用一氧化氮(NO)和TNF-α等炎癥參數驗證香椿葉(toona sinensis leaves, TSL-1)水提取物可以抑制脂多糖,(LPS)激活小膠質細胞介導的神經炎癥效應。研究結果表明,TSL1以濃度依賴的方式抑制LPS誘導NO生產,TNF-α分泌和誘導型NO合酶蛋白表達而不造成細胞毒性，并具有延續后期治療效果[19]。

Park SJ等利用Aβ誘導AD大鼠模型發現，當歸的乙醇提取物INM-176可以減弱海馬中Aβ(1-42)蛋白誘導的星形膠質細胞活化以及海馬CA3區和特定基底核的膽堿能神經元損傷，并且單一或亞慢性施用INM-176還可改善由Aβ(1-42)蛋白誘導的記憶損傷[20]。Yu X給AD模型大鼠灌胃Akebia Saponin D(ASD)4周發現，劑量為30、90和270 mg· kg-1的ASD可改善大鼠的認知損傷。運用組織化學和生物化學方法檢測發現，ASD抑制模型大鼠腦中膠質細胞的激活和TNF-α、 IL-1β和環氧合酶-2(COX-2)的表達，能抵抗ibotenic酸誘導的認知缺陷并減少神經細胞的死亡。這些結果表明，ASD可能是一種潛在的抑制阿爾茨海默病相關神經炎癥和記憶系統功能的藥物[21]。Park SH等在AD果蠅模型中通過測定蛋白磷酸化水平和腦中神經膠質細胞的數量，監測泛神經元表達的增加與細胞外信號調節激酶(ERK)的活化。結果表明，KSOP1009修飾的中國傳統醫藥蘇和祥(SHXW)，可以降低ERK活化水平并減少膠質細胞數量以發揮治療作用[22]。

最近研究表明，靶向性內源性大麻素系統可以認為是治療AD的潛在治療策略。Aso E等在Aβ PP/PS1轉基因小鼠早期癥狀階段給予δ-9四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol, THC)或大麻二酚(cannabidiol, CBD)進行治療，統計迷宮實驗測試數據發現，THC與CBD可以保留模型鼠的記憶力。在THC +/CBD處理的Aβ PP/PS1小鼠中觀察到，可溶性Aβ42肽水平顯著降低斑塊組成改變，表明大麻素可以降低Aβ肽誘導的神經毒性作用。大麻處理的AβPP/ PS1小鼠大腦中星形膠質細胞、小膠質細胞和炎癥相關分子減少，而且THC與CBD聯合治療比THC或CBD單獨治療效果更顯著[23]。這提示在積極的認知效應相關機制中，大麻素的抗炎性質也可能發揮相關作用。Moon M等利用6-姜烯酚治療AD小鼠模型，海馬中Aβ誘導的小膠質和星形膠質細胞增生減少，NGF和突觸前后標記物水平升高[6]。

5 調節細胞凋亡信號分子

在AD進展中，大腦中有相當數量的神經元退化，其中部分神經元死亡是由細胞凋亡介導的。有報道也指出，凋亡性神經元死亡是AD病理的重要組成部分[24]。細胞凋亡是程序性細胞死亡，其核心組成是一組蛋白水解酶稱為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspases)。細胞凋亡信號通路分為外部信號通路和內部信號通路。caspase-8激活繼而caspase-3裂解引起細胞凋亡是外部信號通路發生的過程，也稱為死亡受體途徑[25]。細胞內部信號觸發的凋亡為線粒體途徑，涉及Bcl-2家族的促凋亡成員與線粒體的聯合，促進線粒體外膜透化(MOMP)和細胞色素c(cyt c)釋放到細胞質中，激活caspase-9與caspase-3，進而刺激“凋亡小體”的形成，導致細胞凋亡發生[26]。

韓國紅長參(korean red ginseng, KRG)提取物可抑制由興奮性氨基酸如谷氨酸和NMDA或Aβ(25-35)誘導的神經元損傷和細胞內活性氧(ROS)的產生。KRG提取物顯著增加Ser112的Bad磷酸化，抑制Bax表達和caspase-3活性。結果表明，KRG提取物通過抑制ROS產生和細胞凋亡保護培養的神經元免于興奮性氨基酸和Aβ(25-35)誘導的毒性[27]。據報道，柿葉提取物乙酸乙酯(Extract of persimmon leaves, EAPL)顯示，具有潛在的治療神經退行性疾病作用。Huang SW等給予Aβ(1-42)誘導的模型大鼠口服(po)EAPL發現，200 mg· kg-1、400 mg · kg-1劑量的EAPL可明顯降低超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)活性，提高丙二醛(Malondialdehyde, MDA)水平。此外，EAPL治療可降低p-JNK、Caspase-3的表達及Bax/Bcl-2比值, 減少海馬的神經元凋亡。這些研究表明，EAPL通過調節抗氧化防御系統和線粒體介導的細胞凋亡雙重機制，以改善Aβ誘導的大鼠認知功能障礙[28]。從白芍的水提物中分離的單萜糖苷-芍藥苷(Paeoniflorin，PF)被廣泛用于中醫藥(TCM)治療神經變性疾病，如AD和PD。研究者調查PF對谷氨酸誘導神經毒性培養大鼠嗜鉻細胞瘤(PC12)細胞的保護機制，通過體外培養PC12細胞，MTT法檢測細胞活力，流式細胞術檢測細胞凋亡及線粒體膜電位(MMP)，免疫印跡觀察凋亡相關蛋白(包括Bcl-2和Bax)的表達情況。結果表明，PF以濃度依賴的方式保護PC12細胞免受谷氨酸誘導的損傷，PF的神經保護作用機制與Bcl-2的上調和Bax的下調密切相關，表明PF通過調節線粒體膜電位和Bcl-2 / Bax信號通路，對PC12細胞中谷氨酸誘導的凋亡具有神經保護作用[29]。

6 營養神經元

6.1 神經生長因子(nerve growth factor, NGF)

研究表明，中樞神經系統(CNS)的基底前腦膽堿能系統進行性退化與AD患者認知障礙和癡呆密切相關。鑒于神經元對NGF的高度依賴，有人推測AD的退化是由NGF缺乏造成的，并將這種神經營養素缺乏稱為膽堿能神經元的萎縮。AD的病理復雜且影響到許多神經元，其中基底前腦膽堿能神經元的萎縮以及凋亡在注意力功能中的作用尤為重要。由于NGF對基底前腦膽堿能具有促進再生作用，靶向的NGF傳遞已成為AD潛在治療策略[30]。在尋找模擬NGF活性以預防神經變性疾病的神經活性化合物時，天然藥物的潛在藥用價值激起了學者強烈的興趣[31]。在IBO誘導的AD大鼠模型中，運用中藥補腎益智(bushen-Yizhi, BSYZ)配方，腦免疫組織化學染色顯示，BSYZ顯著上調海馬與皮質中膽堿乙酰轉移酶(ChAT)和NGF的表達，具有促進海馬和皮層中NGF、TrkA和p75mRNA表達增強的趨勢，這些結果表明BSYZ配方可能是治療AD潛在治療藥物[32]。已有文獻證實，姜的生物活性成分6-姜烯酚可以作為抗氧化劑增強神經疾病類患者的記憶力。Moon M等進一步研究發現，6-姜烯酚可以提高海馬中NGF水平和突觸前后標記物，改善Aβ誘導的記憶損傷，顯現出潛在治療AD的效果[6]。

6.2 腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)

腦源性神經營養因子(BDNF)是成人腦中分布最廣泛的神經營養因子，并且通過與其特異性受體-酪氨酸受體激酶B(TrkB)結合，而對神經元具有神經營養作用。此外，BDNF在海馬中維持突觸可塑性是存儲器獲取和整合細胞生物學基礎的關鍵組成部分[33]。因此，BDNF水平和表達或BDNF-TrkB的信號途徑的改變，可能誘導神經元分化不良、突觸損失和認知功能障礙[34]。

Li Y等給予Aβ(25-35)介導的AD大鼠模型口服(po)文冠果提取物(Xanthoceras sorbifolia extracts, XSE)發現，XSE能夠上調海馬CA1區錐體神經元突觸中的主要支架蛋白PSD95，改善樹突棘密度缺乏，提高BDNF的水平和p-TrkB/TrkB 比例，降低RhoA表達及其下游靶蛋白ROCK2。這些結果表明，XSE可以通過腦源性神經營養因子的信號傳導途徑保護樹突棘從而提升認知力[35]。Li F等給予6個月大的APP、PS1轉基因小鼠腹腔注射(IP)25-100 mg·kg-1· d-1丹參酮TIIA(Tanshinone IIA，TIIA)連續30 d，發現50和100 mg.kg-1劑量的TIIA可以使轉基因小鼠記憶障礙得到緩解，且100 mg·kg-1劑量的TIIA可以治療海馬受損的AD模型[36]。Park HR等研究何首烏復合物composition-12(pmc-12)對海馬神經發生及學習記憶的有利影響，以其100或500 mg·kg-1· d-1劑量口服(po)給予雄性C57BL / 6小鼠(5周齡)2周發現，海馬中BDNF和突觸素水平增加，齒狀回神經前體細胞增殖與存活增加[37]。這些結果表明pmc-12可以促進海馬神經生成和提高神經認知功能。

7 總結和展望

AD非單一基因，單一蛋白質疾病，發病機制非常復雜。基因、蛋白質、細胞器、細胞、神經遞質和環境之間相互作用的網絡功能紊亂伴隨神經元細胞進行性死亡是AD進展的特征表現。目前認為，Aβ是AD發病的驅動因素，因而抑制Aβ的神經細胞毒性，阻斷神經膠質細胞過度炎癥反應與氧化應激，維持線粒體呼吸鏈正常反應從而改善突觸功能，減少神經遞質失調及神經元損害等在AD發病早期發揮著重要作用。在AD進展中，神經元不斷萎縮消失，營養神經元有延緩進展、改善癥狀的作用。開發保護神經元的新藥至關重要，但作用于單一的特異靶點的臨床藥物治療并未取得理想效益。目前AD的臨床治療主要依靠乙酰膽堿酯酶抑制劑或N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑，但這些臨床藥物治療只能緩解疾病癥狀，不能阻止其進展。因此，開發多靶點配基的天然藥物來治療AD成為研究熱點。部分天然藥物在AD動物模型中顯示出有益的結果，但是能否將其運用于臨床治療仍需要大量的實驗研究和臨床試驗提供證據。