應用多重PCR快速鑒定自然發酵肉制品中6 種葡萄球菌

許隨根，陳 曦*，李家鵬，李金春，楊君娜，熊蘇玥，戚 彪，米瑞芳，黃 鑫，喬曉玲，王守偉*

（中國肉類食品綜合研究中心，北京食品科學研究院，國家肉類加工工程技術研究中心，肉類加工技術北京市重點實驗室，北京 100068）

在自然發酵肉制品中，木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌、馬胃葡萄球菌和松鼠葡萄球菌通常是占據優勢地位的葡萄球菌菌種[1-8]，它們在發酵肉制品生產過程中能夠產生脂肪酶和蛋白酶，對發酵肉制品風味品質的形成起著重要作用[9]，同時還能產生硝酸還原酶和一氧化氮合酶影響發酵肉制品色澤[10]，同時還產生過氧化氫酶具有抗氧化活性[11]，其中，木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌是目前商業肉品發酵劑所用菌種的重要來源[12]。快速準確地識別和鑒定自然發酵肉制品中的葡萄球菌，可大大提高優良肉品發酵劑葡萄球菌菌株的篩選鑒定效率，也有利于建立基于葡萄球菌菌群變化的發酵肉制品質量監控技術。

葡萄球菌屬的許多種其菌落形態、菌體特征相似難辨，生理生化特性也存在許多相似之處。傳統的生理生化實驗耗時費力，Vitek 2鑒定系統、脂肪酸分析等則成本較高，不能滿足發酵肉制品葡萄球菌檢測中的快速、準確、低成本的需要[13]。目前，許多非培養方式鑒定技術被用于葡萄球菌的鑒定，包括種特異性聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）、16S rDNA測序、聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）[14-15]、隨機擴增多態性DNA標記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性技術（polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）等[16-17]、基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（matrixassisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）[18-19]。在眾多非培養方式鑒定方法中，特異性PCR技術以其快速、準確、簡單及低成本等優點備受青睞，已得到了廣泛應用[20]。至今，馬胃葡萄球菌、木糖葡萄球菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肉葡萄球菌的單菌種特異性PCR檢測方法已經先后被建立[21-26]。

本研究以發酵肉制品中常見的肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌、馬胃葡萄球菌和松鼠葡萄球菌為研究對象，設計和篩選菌種特異性引物，優化PCR體系，建立6 種葡萄球菌的多重PCR鑒定方法，應用于發酵肉制品微生物檢測過程中的葡萄球菌快速識別與鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 菌株

建立多重PCR方法體系所用菌株：1 株為本實驗室篩選，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心；2 株購自丹麥科漢森公司，17 株購自中國工業微生物菌種保藏管理中心（CICC），詳見表1。多重PCR方法體系驗證所用菌株：本實驗室從傳統肉制品中分離得到，并采用Vitek 2微生物生理生化鑒定儀對菌株進行種屬鑒定。

表1 實驗菌株Table 1 Bacterial strains used in this study

1.1.2 試劑

營養肉湯培養基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（MSA）肉湯（MRS）、胰蛋白胨大豆肉湯、腦心浸液肉湯 北京陸橋技術股份有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒 北京天根生物技術有限公司；Premix TaqTM酶混合液 大連寶生物工程有限公司；SYBR Green I染料 北京康普生物技術有限公司；無水乙醇 北京化工集團；MCE-202 MultiNA微芯片電泳試劑盒 島津企業管理（中國）股份有限公司。

1.1.3 儀器與設備

PB-10 pH計 德國賽多利斯公司；GI54DWS全自動高壓滅菌器 美國致微（廈門）儀器有限公司；ESCO二級生物安全柜 新加坡藝思高科技有限公司；T100TMThermal Cycler型PCR儀美國伯樂公司；5417R冷凍離心機 德國艾本德公司；B-260恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠；MCE-202 MultiNA微芯片電泳系統 島津企業管理（中國）股份有限公司；Vitek 2 Compact全自動微生物鑒定分析系統法國生物梅里埃公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗菌株的培養

將表1中實驗菌株分別接種于100 mL培養基中，37 ℃振蕩培養。其中腐生葡萄球菌、肉葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌分別取培養2、4、6、8、12、24、48 h菌液，用無菌生理鹽水10 倍系列稀釋后，合適的稀釋度取1 mL傾注于MSA平板，37 ℃培養48 h后計數。

1.2.2 細菌基因組DNA的制備

根據細菌基因組DNA試劑盒說明書進行。

1.2.3 特異性引物設計

選擇表1中菌的rpoB、gap、hsp60、tuf、sodA基因作為目的基因，用BioEdit比較其gap、rpoB、hsp60、tuf、sodA基因的基因序列，之后用Oligo7軟件設計3 對特異性引物，引物確定后，使用BLAST程序通過GenBank對各引物及擴增產物同源性進行比對，最終確定利用肉葡萄球菌的gap基因、腐生葡萄球菌和木糖葡萄球菌的rpoB基因設計菌種特異性引物。馬胃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌則利用已經報道的引物，所有引物由上海英駿生物技術有限公司合成（表2）。

表2 用于多重PCR的特異性引物Table 2 Specific primer sequences for multiplex PCR

1.2.4 引物的特異性檢測

提取表1中實驗菌株的基因組DNA作為模板，然后進行PCR擴增。針對引物添加量、退火溫度、循環數等進行優化，確定最適反應體系。采用25 μL的PCR體系，其中Premix Taq?酶混合液12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，模板DNA 2 μL，加無菌重蒸水補足至25 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，進行32 個循環；循環結束后72 ℃延伸10 min，冷卻到4 ℃，產物4 ℃保存備用。取10 μL擴增產物進行微芯片電泳檢測。

1.2.5 多重PCR體系建立

將表2的6 對引物進行混合，以各目的菌株的DNA作為模板檢測多重PCR特異性，針對引物添加量、退火溫度、循環數進行優化，根據文獻報道各引物對在多重PCR過程中呈相互抑制的關系，適當的調節引物濃度配比可以有效避免目標條帶漏檢的現象，是影響多重PCR有效擴增目標條帶的關鍵因素[30]，首先設計不同引物濃度梯度的組合體系（表3中組合體系1～5），之后根據各引物所產生的條帶亮度調整不同菌種引物濃度（表3中組合體系6～21），以擴增出均一、清晰、明亮且特異性良好的目的條帶為標準，最終確定多重PCR體系為50 μL，包括Premix Taq?酶混合液25 μL，引物F（10 μmol/L）、引物R（10 μmol/L）各6.1 μL（引物F、引物R為6 種菌特異性引物按比例混合組成），每種菌模板DNA各1.5 μL，加無菌重蒸水補足至50 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸1 min，進行32 個循環；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。產物經微芯片電泳檢測。

表3 引物添加量及組合體系Table 3 Primer addition and combination systems

1.2.6 多重PCR特異性檢測

采用優化的多重PCR體系，分別以腐生葡萄球菌、肉葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌的DNA以及6 種菌的DNA混合體為模板進行多重PCR特異性檢測實驗。

1.2.7 多重PCR靈敏度檢測

將6 種菌分別培養至對數生長期，用無菌生理鹽水進行10 倍系列稀釋后，平板計數；同時提取各稀釋度的菌體DNA，利用多重PCR方法進行檢測。

提取6 種菌對數生長期的菌體DNA，檢測濃度后分別進行10 倍系列梯度稀釋，以各稀釋度DNA作為模板進行多重PCR檢測。

1.2.8 多重PCR準確性驗證

采用建立的多重PCR方法對傳統肉制品中分離的8 株葡萄球菌進行鑒定，其結果與8 株菌利用16S rDNA序列分析、生理生化鑒定結果對比，驗證本實驗建立的鑒定方法的準確性。

1.2.9 PCR產物的微芯片電泳檢測

本實驗使用MCE-202 MultiNA 微芯片電泳系統，具體操作參照其使用說明書。

1.3 數據分析及圖像處理

利用Excel 2010、SPSS19軟件進行數據處理和分析；微芯片電泳圖像利用MultiNA viewer軟件進行圖像處理。

2 結果與分析

2.1 引物的特異性檢測結果

圖1 引物特異性驗證結果Fig. 1 Validation of the specificity of the primers

分別利用菌種特異性引物對表1中菌株進行PCR檢測，結果如圖1所示。所有目標菌株均產生預期條帶，且沒有非特異性條帶出現，非目標菌株則都沒有擴增出任何條帶。表明實驗所用的6 對引物具有很好的特異性，能夠應用于這6 種葡萄球菌的種屬鑒定。

2.2 多重PCR體系建立

多重PCR擴增結果受dNTP濃度、引物、Mg2+濃度、Taq聚合酶、擴增條件等諸多因素影響[31]。根據文獻與聚合酶預混液試劑盒說明書，首先確定多重PCR體系總體積、Taq聚合酶預混液添加量和模板DNA添加量。針對引物添加量進行優化，多重PCR引物濃度優化結果如圖2所示，不同比例的引物用量擴增的結果有所不同，引物用量較低時，會出現目標條帶未被擴增的現象。而當引物用量過高時，會導致單一目標條帶過于明亮且彌散。當6 種目標菌的引物濃度配比差異過大，易出現雜帶擴增的現象，圖2中1～4泳道，由于腐生葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌引物濃度含量較低（4 種引物用量均低于0.4 μL），因此，4 種菌的相應條帶較暗或者未被擴增，16～19泳道，由于肉葡萄球菌引物濃度過低（引物用量0.2 μL），出現其目標條帶未被擴增現象，5泳道，當6 種菌引物用量過高（6 種菌引物用量1.5 μL），又導致目標條帶過于明亮且彌散，同時出現非特異性擴增，6～8和12～15泳道，均有雜帶擴增現象，20～22泳道，均可擴增出6 條清晰、明亮且特異性良好的條帶。考慮到條帶明亮度的均一性及最大限度地提高擴增效率，最終，確定多重PCR體系中，木糖葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、表皮葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、肉葡萄球菌和腐生葡萄球菌的引物添加量分別為0.6、1、1、1.5、1、1 μL（引物組合體系20）。

圖2 體系優化電泳結果Fig. 2 Electrophoretic results from system optimization

2.3 多重PCR特異性檢測結果

利用上述建立的多重PCR體系，分別以腐生葡萄球菌、肉葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌DNA作為模板，進行多重PCR特異性驗證。如圖3所示，目標菌株均擴增出預期大小的條帶，無非特異性擴增條帶出現，陰性對照未擴增出任何條帶，表明該體系可同時擴增出6 種葡萄球菌，引物間未發生交叉錯配現象，結果表明建立的多重PCR體系具有很好的種間特異性。因此，可利用該方法檢測自然發酵肉制品中葡萄球菌群落，或對已分離純化的葡萄球菌菌株進行快速種屬鑒定。

圖3 多重PCR特異性驗證結果Fig. 3 Validation of the specificity of multiple PCR

2.4 多重PCR的靈敏度檢測結果

2.4.1 多重PCR檢測單菌種的菌落數檢出限

利用平板計數方法，確定腐生葡萄球菌、肉葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌的菌液初始濃度分別為4.6×107、6.5×107、7.7×107、7.4×107、6.1×107、9.1×107CFU/mL。每種葡萄球菌的培養液經10 倍梯度稀釋后，提取DNA進行多重PCR，結果如圖4所示，腐生葡萄球菌、肉葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌的檢出限分別為4.6×101、6.5×102、7.7×101、7.4×101、6.1×101、9.1×101CFU/mL。目前肉制品中這6 種葡萄球菌檢出限相關報道較少。Shome等[29]應用多重PCR方法檢測了牛奶中的松鼠葡萄球菌和表皮葡萄球菌，檢出限分別為103CFU/mL和102CFU/mL，與之相比本實驗多重PCR方法的靈敏度更好；姜彥君等32]報道了食品中3 種致病菌的多重PCR鑒定方法，其中金黃色葡萄球菌檢出限為101CFU/mL，與本實驗結果一致。

圖4 多重PCR檢測單菌種的菌落數檢出限Fig. 4 Detection limit of multiple PCR for colony counts of single strains

2.4.2 多重PCR檢測單菌種的DNA含量檢出限

測定腐生葡萄球菌、肉葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌的DNA的初始質量濃度分別為110、155、144、169、187、228 μg/mL，10 倍系列梯度稀釋后，以各稀釋度DNA作為模板進行PCR檢測。圖5各圖分別顯示其1～7泳道都擴增出目的條帶，陰性對照均未擴增出條帶，分析結果可以知道腐生葡萄球菌、肉葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌的DNA的多重PCR檢出限分別為0.22、0.31、0.288、0.338、0.374、0.456 pg。

圖5 多重PCR檢測單菌種的DNA含量檢出限Fig. 5 Detection limit of multiple PCR for genomic DNA from single strains

2.4.3 多重PCR檢測多菌種的菌落數檢出限

分別提取6 種菌的各稀釋度菌體DNA，并將同一稀釋度的6 種菌體DNA同比例混合后作為模板進行多重PCR，擴增產物利用微芯片電泳進行檢測。如圖6所示，腐生葡萄球菌、肉葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌的多重PCR檢出限分別為4.6×102、6.5×102、7.7×102、7.4×102、6.1×102、9.1×102CFU/mL。檢測結果表明實驗建立的多重PCR方法具有較好的靈敏度。劉紅玉等[33]報道了多重PCR同時檢測肉中4 種致病菌，檢出限與本實驗結果一致。

圖6 多重PCR檢測6 種葡萄球菌的檢出限Fig. 6 Detection limit of six strains detected by multiplex PCR

2.4.4 多重PCR檢測多菌種的DNA含量檢出限

將6 種葡萄球菌的DNA進行等量混合，10 倍系列梯度稀釋后進行多重PCR檢測，如圖7所示，腐生葡萄球菌、肉葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌的DNA含量檢出限分別為2.2、3.1、2.88、3.38、3.74、4.56 pg。錢志偉等[34]建立了乳制品中3 種致病菌多重PCR檢測體系，金黃色葡萄球菌檢出限為3.8 pg；胡冰雪等[35]建立肉制品中熒光假單胞菌、沙門菌和單核細胞性李斯特菌的多重PCR檢測方法，DNA檢測限為1 pg，與本實驗結果一致。

圖7 多重PCR檢測6 種葡萄球菌DNA的檢出限Fig. 7 Detection limit of multiplex PCR for genomic DNA from six Staphylococcus strains

2.5 多重PCR準確性驗證

從貴州地區采集了3 種不同工藝的自然發酵酸肉，提取了酸肉微生物群落總DNA。利用本實驗建立的多重PCR鑒定方法，從酸肉微生物群落中檢測到了這6 種葡萄球菌。為進一步驗證多重PCR檢測的準確性，利用傳統分離培養方法，從酸肉中分離純化了若干葡萄球菌，其中8 株葡萄球菌經過16S rDNA序列分析、生理生化鑒定為松鼠葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、木糖葡萄球菌和腐生葡萄球菌。同時利用多重PCR對這8 株菌進行鑒定，結果見表4，可知不同方法對8 株菌的鑒定結果一致，因此，本實驗建立的多重PCR方法具有較高的種間特異性，可快速、準確地用于發酵肉制品中肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌、表皮葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、松鼠葡萄球菌和腐生葡萄球菌的檢測和鑒定，具有較好的應用前景。

表4 兩種鑒定方法檢測結果對照Table 4 Comparison of multiplex PCR and automated microbial Identification system for the detection of Staphylococcus

3 結 論

本實驗設計、篩選6 種凝固酶陰性葡萄球菌的特異性引物，通過優化引物濃度、PCR擴增體系、擴增條件、檢測系統等建立特異性好且穩定的多重PCR快速鑒定葡萄球菌的體系，此體系將傳統方法中大量的生化試驗轉化為一次性PCR擴增，具有操作簡便、快速、靈敏度高等特點，便于批量檢測，而且相對傳統鑒定方法檢測成本大大降低。PCR產物利用微芯片電泳檢測系統，此檢測系統靈敏度高、檢測時間短[36]，相比傳統電泳系統大大縮短檢測時間。本實驗建立的多重PCR體系檢出限達到2×102CFU/mL，DNA含量檢出限達到4 pg，具有較好的靈敏度和特異性，利用實驗建立的多重PCR鑒定體系3 h就可以判定出結果，相比傳統的生理生化實驗省時省力，多重PCR法相比Vitek 2鑒定系統、脂肪酸分析等則成本較低，能夠滿足不具備Vitek 2鑒定系統科研單位和科研工作者的鑒定需求，具有較好的應用前景。