比色法與HPLC法對比測定桑葉茶中γ-氨基丁酸的含量

湯彩云，王 濤，屠 潔，劉冠卉*，黎 鵬，趙 靜

（1.江蘇科技大學生物技術學院，江蘇 鎮江 212018；2.江蘇科技大學糧食學院，江蘇 鎮江 212000）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種四碳非蛋白質組成的氨基酸，廣泛存在于微生物、動植物內。在植物中，GABA是一種主要在谷氨酸脫羧酶催化L-谷氨酸脫羧下生成的代謝產物[1]。在哺乳動物的腦內，GABA是一種主要的抑制性神經遞質，具有調節血壓、抑制癌細胞增殖、預防阿爾茨海默病、治療失眠等多種重要的生理功能[2]。近年來，富含GABA的食品已成為研究熱點，研究者們普遍采用發酵或營造植物逆境條件的方法開發富含GABA的稻谷、小麥、茶葉、發酵食物等[3-6]。

桑葉是衛生部公布的藥食同源食品，具有豐富的營養價值和多種藥用功能，開發前景廣闊[7-8]。已研發了以桑葉茶（下稱桑茶）為代表的系列桑葉食品。在桑葉中，谷氨酸含量（以干物質計）高達23.23 mg/g[9]，因此桑葉是開發GABA食品的潛在資源。桑茶是按照茶葉加工方法生產的代用茶，已有研究報道，經過富集處理后的桑茶中GABA含量可達3.87 mg/g[10]，遠超業界關于茶中GABA含量為1.5 mg/g的認定標準。

目前，GABA含量測定的方法主要有紙層析法[11]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[12]、液相色譜-質譜聯用[13]、氨基酸分析儀[14]、基于Berthelot反應的可見光比色法[15]、基于酶反應的紫外比色法[16]等。其中，HPLC、液相色譜-質譜、氨基酸分析儀檢測結果更加精確，但前處理繁瑣[17]。Berthelot比色法最為方便快捷且成本低廉，但易受樣品中其他成分干擾。魏珍珍等[18]發現無法用Berthelot比色法準確測定茶葉中GABA含量；何秋云等[19]檢測馬鈴薯中GABA時也發現Berthelot比色法的誤差極大。目前，鮮見關于Berthelot比色法與HPLC法定量桑茶中GABA的比較研究。為此，本研究采用HPLC和基于Berthelot反應的酶標儀分別進行方法學驗證并比較，旨在尋求一種快速準確測定桑茶中GABA含量的方法，以期為大通量篩選合適的桑葉品種、葉片部位和桑茶加工工藝提供理論依據。

1 料材與方法

1.1 材料與試劑

桑葉：育711、大十、魯山桑采自國家桑種質資源鎮江桑樹圃；粵桑購自廣西玉林桑樹圃；湖桑購自河南信陽桑樹圃；荊桑購自山東泰安。

GABA（純度≥99%）、乙酸鈉、冰醋酸、碳酸氫鈉、磷酸二氫鉀、無水乙醇、四硼酸鈉、重蒸酚、次氯酸鈉（活性氯≥7.5%）、2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene，FDBN）（均為分析純），甲醇、四氫呋喃（均為色譜純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海三發科技儀器有限公司；BK-FD10S冷凍干燥機 濟南展康醫療器械有限公司；DFT-150手提式粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；HH·S21-6-S電熱恒溫水浴鍋 上海精其儀器有限公司；1260 HPLC儀 美國Aglient公司；SpectraMaxi3酶標儀 美國Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將干燥的桑茶粉碎，過100 目篩。依據茶葉沖泡習慣，并參照Huang等[20]的提取方法，取適量桑茶粉末按照料液比1∶40（g/mL），用沸水浸泡，充分混勻后在40 ℃水浴1 h，每隔20 min振蕩1 次。取出后濾紙過濾，濾液再過0.45 μm濾膜得桑茶待測提取液。

桑葉樣品處理同上。

1.3.2 比色法

取系列質量濃度的GABA標品溶液1.0 mL，加入0.1 mol/L四硼酸鈉緩沖液1.0 mL，再依次加入質量分數分別為4%、5%、6%、7%、8%的重蒸酚溶液1.2 mL，質量分數分別為4%、5%、6%、7%、8%的次氯酸鈉溶液0.6 mL混勻，分別于沸水浴5、10、15、20、25 min后立刻冰浴5 min，至室溫待其出現藍綠色時再加入60%乙醇溶液2.0 mL，測定吸光度。

1.3.3 HPLC法

參考Somasundaram等[21]的測量方法。衍生處理：取0.2 mL提取液與0.1 mL 0.5 mol/L的NaHCO3溶液混合，加入0.02 mL體積分數為1% FDBN（由乙腈稀釋）溶液與0.18 mL超純水，密封。搖勻后在60 ℃水浴鍋中暗反應1 h，取出冷卻至室溫后加入0.4 mL 0.01 mol/L的KH2PO4溶液，搖勻放置15 min，離心待測。

HPLC條件：Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm）；流動相A為0.05 mol/L的乙酸鈉緩沖溶液（pH 5.7，體積分數2%冰醋酸調pH值，加入四氫呋喃30 mL/L），流動相B為甲醇；洗脫程序：0～20 min，70% A；20～35 min，50% A；35～60 min，30% A；60～90 min，0% A；流速1 mL/min；柱溫28 ℃；檢測波長360 nm；進樣量10 μL。

1.4 數據統計

數據以 ±s表示，顯著性差異分別用t檢驗和單因素方差分析（SNK法），采用SPSS 22.0軟件分析。

2 結果與分析

2.1 比色法標準曲線的繪制

2.1.1 顯色條件的優化

根據1.3.2節方法進行顯色反應，掃描光譜后，在波長640 nm處出現最大吸收波長，因此，選擇640 nm為檢測波長。如圖1所示，取0.1 mg/mL的GABA標準品溶液1.0 mL，加入0.1 mol/L四硼酸鈉緩沖液1.0 mL，6%重蒸酚溶液1.2 mL，7%次氯酸鈉溶液0.6 mL混勻，于沸水浴10 min后體系的吸光度最高。

圖1 重蒸酚、次氯酸鈉與沸水浴時間對吸光度影響Fig. 1 Effects of phenol, NaClO and boiling water bath time on absorbance

2.1.2 標準曲線的建立

從2.0 mg/mL的標準品溶液中分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，加入去離子水定容至1.0 mL，再加入顯色劑進行顯色反應，測吸光度，結果表明，在0.2～1.0 mg/mL范圍內，吸光度與GABA質量濃度呈良好的線性關系。線性方程為Y=0.295 4x+0.026 1，R2=0.990 3。

2.2 HPLC法標準曲線的繪制

2.2.1 GABA標準品檢測

配制1.0 mg/mL的GABA標準品溶液，按1.3.3節衍生后進樣檢測。GABA標準品的色譜圖如圖2所示，GABA的保留時間為7.009 min。

圖2 樣品與標準品的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of sample and GABA standard

2.2.2 樣品中GABA含量檢測

稱取1.0 g桑茶粉末，按1.3.1節方法提取，按1.3.3節方法檢測，如圖2所示，在7.013 min發現目標峰，且目標峰與鄰近峰分離度好，該檢測條件適宜。

2.2.3 標準曲線的建立

配制1.0 mg/mL的GABA標準品溶液稀釋成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的標準液，衍生后進樣。以峰面積為縱坐標，標準液質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。得到線性方程為Y=7 796.59X－485.24，R2=0.994 4，在GABA質量濃度為0.1～0.5 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.3 檢測方法的驗證

2.3.1 精密度實驗結果分別取1 mL 1.0 mg/mL GABA標準溶液與1.0 g桑茶樣品，按1.3.2節與1.3.3節方法，在不同的時段各重復測量6 次，結果見表1。采用比色法與HPLC法測量，日內精密度與日間精密度的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）均在2%以內，表明這2 種實驗方法的精密度良好。比色法平均相對標準偏差為1.28%，HPLC法為0.37%。且不同時間內采用HPLC法測量的RSD均小于比色法，表明HPLC法測量的結果更精確。

表1 分析方法的精密度實驗（n= 6）Table 1 Precision of the colorimetric and HPLC methods (n= 6)

2.3.2 回收率實驗結果

表2 分析方法的回收率實驗（n=3）Table 2 Recovery of the colorimetric and HPLC methods (n= 3)

取0.5 g桑茶樣品提取后依次加入0.2、0.4 mg/mL和0.6 mg/mL的GABA標準液1.0 mL。然后分別采用比色法和HPLC法測量并計算回收率。如表2所示，2 種測量方法的平均回收率均大于98%，表明實驗方法準確可行；比色法的加標平均回收率為98.46%，小于HPLC法的平均回收率（100.10%），表明采用HPLC法測量GABA時準確度更高。此外，2 種方法的RSD均小于2%，顯示了2 種實驗方法均具有良好的精度。

2.4 2 種檢測方法的比較

分別采用2 種實驗方法對桑茶樣品和1.0 mg/mL標準液進行檢測，對檢測結果進行t檢驗。t桑=2.037、t標=0.551、t0.05(10)=2.228，t桑和t標均小于t0.05(10)，表明比色法和HPLC法測量桑茶GABA無統計學差異。

2.5 桑茶中GABA的含量

分別將不同地區與品種的桑葉以凍干、微波干燥、烘箱烘干3 種方式干燥至恒質量；另取同一批次的鎮江地區新鮮桑葉，分別按紅茶與綠茶加工工藝制成桑葉紅茶和桑葉綠茶（桑茶采用烘干干燥，具體為110 ℃加熱30 min，然后90 ℃至恒質量）。然后各稱取1.0 g樣品采用比色法與HPLC法檢測GABA含量，結果見表3。

表3 桑茶和桑葉中的GABA含量Table 3 GABA contents in mulberry leaf tea and mulberry leaves mg/g

結果表明，干燥方式不同，GABA的含量不同。凍干桑葉中GABA含量最高，微波干燥次之，烘干桑葉最低。這可能與加熱的時間與溫度有關[22]。李赟等[23]研究表明，高溫烘焙，會使面包中的GABA含量降低；Katsube等[24]發現冷凍干燥較噴霧干燥對速溶紅茶中的GABA影響較小。

桑葉在制成桑茶后，與烘干相比GABA含量極顯著提高（P＜0.01）。這可能是由于桑葉離體后，在攤晾、萎凋、碰撞、揉捻過程中，谷氨酸脫羧酶活力增強，由谷氨酸生產GABA有關[5,25]。本次加工所得的桑葉紅茶中GABA含量略高于桑葉綠茶，這可能是由于桑葉紅茶多了發酵工藝所致，但二者均未達到150 mg/100 g的標準，這提示可能需要在加工中采用厭氧[3]、浸泡[26]、低溫[27]等方式來進一步富集GABA。

對不同品種制得的桑葉紅茶、桑葉綠茶和干燥桑葉，分別采用比色和HPLC法進行測量GABA含量，經t檢驗，2 種檢測方法無統計學差異。

3 結 論

GABA理論上可采用Berthelot反應[28]定量測量。但是，桑葉樣品中含有的微量氨、銨鹽、酰胺等物質[29]以及色素[30]，可能會影響測量結果。本研究表明，Berthelot比色法可準確定量測量干燥桑葉或桑茶中的GABA含量，測定條件為提取液1.0 mL加入0.1 mol/L四硼酸鈉緩沖液1 mL，再依次加入6%的重蒸酚溶液1.2 mL、7%的次氯酸鈉溶液0.6 mL混勻，沸水浴10 min后立刻冰浴5 min，至室溫待其出現藍綠色時再加入60%乙醇溶液2 mL，波長640 nm處測定吸光度。

比色法、HPLC法均可準確定量測量桑茶及桑葉中的GABA。比色法的平均相對標準偏差為1.28%，平均回收率為98.46%；HPLC法的平均相對標準偏差為0.37%，平均回收率為100.10%。2 種檢測方法均符合中國藥典要求，經t檢驗比較分析，2 種檢測方法無統計學差異。

不同加工工藝對桑葉中GABA含量有影響。桑葉加工成桑茶后，GABA含量高于烘干桑葉。同一品種桑葉制成的桑葉紅茶的GABA含量略高于桑葉綠茶。經t檢驗比較分析，2 種檢測方法無統計學差異但比色法更加方便快捷，對于桑茶的選材、加工和貯藏，以及桑葉系列食品的開發更有現實意義。