擬穴青蟹軟殼蟹與硬殼蟹的小分子營養物質組成差異

鄭敏陽，詹萍萍，母昌考，王春琳，葉央芳*

（寧波大學 應用海洋生物學教育部重點實驗室，浙江 寧波 315211）

蛻殼是甲殼動物生長發育過程中的一個重要生命活動，老的殼被蛻去，隨之新的殼被重建[1-2]。剛蛻殼的蟹被稱為軟殼蟹，因其方便食用、高鈣低脂等特性越來越受到消費者青睞[3]。目前，已有多種蟹類被制作成軟殼蟹，包括雪蟹（Chinoecetes opilio）[4]、鋸緣青蟹（Scylla serrata）[5-6]、紅星梭子蟹（Portunus sanguinolentus）[7]和三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）[3]等。Sudhakar等[7]發現紅星梭子蟹軟殼蟹的蛋白質、碳水化合物、脂類、礦物質和氨基酸含量均低于硬殼蟹，軟殼蟹的營養價值不及硬殼蟹。而且，雪蟹和鋸緣青蟹軟殼蟹肌肉的蛋白質含量也低于硬殼蟹[5]。盡管三疣梭子蟹軟殼蟹的蛋白質和脂類含量也比硬殼蟹低，但氨基酸和脂肪酸水平卻與硬殼蟹相當。值得關注的是，三疣梭子蟹軟殼蟹的鈣含量顯著高于硬殼蟹，因此軟殼蟹可能是一種補鈣佳品[3,8]。擬穴青蟹（Scylla paramamosain）是我國東南沿海重要的經濟蟹類之一，因其味道鮮美、營養價值高而廣受消費者歡迎[9]，由其制作的軟殼蟹更是受到老人和孩子的喜愛。然而，擬穴青蟹軟殼蟹的營養價值是否低于硬殼蟹目前鮮見報道，因此，有必要對擬穴青蟹軟殼蟹和硬殼蟹之間的營養物質組成差異進行比較分析。

傳統的食品組分分析主要測定蛋白質、脂類和碳水化合物等總量，隨著技術的發展，這種寬泛的組分分析方法已逐漸精細到有機小分子營養物（代謝物）的整體組成分析方法[10]。基于核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）的代謝組學技術正是定性和定量分析小分子代謝物的有力工具[11-12]，并已在蟹類腸道代謝物解析[13]、蟹類種類鑒別[14]、蟹糊級別鑒別[15]、蟹糊發酵過程中的質量評價[16]以及蟹類在生理和病理條件下的代謝機理解析[17-18]中得到成功應用。因此，本研究采用基于NMR的代謝組學技術并結合多變量統計分析方法比較擬穴青蟹軟殼蟹與硬殼蟹肌肉和肝胰腺之間的營養物質組成差異，為正確評估軟殼蟹的營養價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活的擬穴青蟹硬殼蟹購自福建三門一水產交易市場，為獲得數量足夠的軟殼蟹，購買60 只硬殼的雄性青蟹，每只蟹質量約250 g，分別單養在配備有循環水的蟹公寓中，鹽度控制在20‰～25‰。

甲醇、二水合磷酸二氫鈉、三水合磷酸氫二鉀（均為色譜純） 上海國藥集團化學試劑有限公司；2,2,3,3-氘代三甲基硅烷丙酸鈉（sodium 3-trimethylsilyl [2,2,3,3-2D4]propionate，TSP）、重水（99.9%氘代）（均為色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司。

用50%重水溶液配制0.15 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4），內含1.0×10－5g/mL TSP[19]。配制甲醇-水（2∶1，V/V）溶液作為組織胞內物質的提取液。

1.2 儀器與設備

Avance III 600 MHz核磁共振譜儀（配有超低溫探頭）德國Bruker Biospin公司；TD-XBYM組織破碎儀 北京同德創業科技有限公司；5415R低溫高速離心機 德國Eppendorf公司；2.5 L冷凍干燥機 美國Labconco公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

從硬殼蟹中隨機選取9 只青蟹作為硬殼蟹樣品，采集青蟹游泳足肌肉和肝胰腺各約500 mg，用液氮速凍后－20 ℃保存備用。密切觀察青蟹蛻殼情況，并記錄每只青蟹的蛻殼時間，收集蛻殼時間為0 h和3 h的軟殼蟹各9 只，樣品處理方法同硬殼蟹。

1.3.2 營養物質提取

為提取青蟹肌肉和肝胰腺組織中的胞內物質，先在每個樣品中分別加入1 mL甲醇提取液，然后置于組織破碎儀中，設置破碎頻率為20 Hz，破碎時間為90 s。所得提取物在4 ℃、12 000 r/min離心10 min，以獲得上清液。殘渣再用1 mL甲醇提取液提取1 次。合并2 次提取所得的上清液，置于真空條件揮發上清液中的甲醇，進一步冷凍干燥。在冷凍干燥粉中加入600 μL磷酸緩沖液，充分混勻，經4 ℃、12 000 r/min離心10 min后，將500 μL上清液移入直徑為5 mm的核磁管中，備用。

1.3.3 青蟹肌肉和肝胰腺提取物的NMR分析

在298 K條件下采集樣品的1H NMR譜，所用的脈沖序列是標準的NOESYGPPR1D：RD-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ，對應的質子共振頻率為600.13 MHz。為抑制水峰，設置等待時間為2 s，混合時間為100 ms，并施加強度約50 Hz的低功率連續波。對于每個1H NMR譜，均設置90°脈沖寬度約10 μs，譜寬為δ 20，采樣點數為32 K，自由感應信號累加次數為64 次。把采集到的1H NMR譜的自由感應信號先乘以增寬因子為0.5 Hz的指數窗函數，再進行傅里葉變換，根據內標物TSP（δ 0.0）的化學位移，手動定標1H NMR譜，并作相位和基線校正。分別選擇一個具有肌肉和肝胰腺提取物典型1H NMR譜的樣品用于二維NMR譜采集，采集的二維NMR譜包括同核COSY和TOCSY譜，異核HSQC和HMBC譜。二維譜的實驗參數設置參見婁永江等[20]的方法。

1.3.4 NMR數據的多變量統計分析

對樣品的1H NMR譜進行分段積分，選取肌肉樣品的譜區間為δ 9.50～0.80，去除δ 5.00～4.70和δ 3.40～3.34的信號區間以消除水和甲醇的干擾；選取肝胰腺的譜區間為δ 9.70～0.75，去除水和甲醇的信號區間分別為δ 5.05～4.75和δ 3.37～3.34。所有1H NMR譜的積分區間均設置為2.4 Hz。為消除樣品之間的重量差異，對上述積分數據進行了重量歸一化處理。把歸一化的NMR數據導入SIMCA-P+軟件（V11.0，瑞典Umetrics公司），選擇標準化的數據處理模式對NMR數據作主成分分析（principal component analysis，PCA），以獲得樣品的聚類情況。對不同蛻殼時間的軟殼蟹分別與硬殼蟹進行兩兩比較的正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal projection to latent structures-discriminant analysis，OPLS-DA），在OPLS-DA中，先對1H NMR數據進行自動規格化處理，并設為X變量，把分組信息設為Y變量。采用8 倍交叉驗證和交叉驗證的方差分析（cross validation-analysis of variance，CV-ANOVA）方法驗證OPLS-DA模型的可靠性。OPLS-DA模型的Q2值越高且P值小于0.05，說明模型是可靠的[21]。再利用MATLAB軟件制作OPLS-DA模型的相關系數圖，以獲得導致兩組區分的具有顯著性意義的物質。其中，以回溯轉換處理[22]的NMR數據作為X變量，以分組信息為Y變量，這2 個變量之間的皮爾森積差相關系數（r）值作為營養物質在兩組間是否具有顯著性差異的標準，并以顏色代表其顯著性，顏色越暖（如紅色）表示顯著性越大，反之，顏色越冷（如藍色）表示顯著性越小。在本研究中，當某一營養物質的|r|大于0.632時，該物質對組間區分達到顯著水平（P＜0.05）。

為獲得軟殼蟹與硬殼蟹的營養物質差異，按下式計算不同時間采集的軟殼蟹的營養物質相對于硬殼蟹的相對變化率：

式中：Ci和C0分別為營養物質在軟殼蟹和硬殼蟹中的濃度。

2 結果與分析

2.1 擬穴青蟹肌肉和肝胰腺的營養物質組成

圖1 擬穴青蟹肌肉和肝胰腺提取物的典型600 MHz 1H NMR譜Fig. 1 Typical 600 MHz 1H NMR spectra of the extracts of muscle and hepatopancreas of S. paramamosain

表1 擬穴青蟹肌肉和肝胰腺營養物質的NMR數據Table 1 NMR data of nutrients detected in the muscle and hepatopancreas of S. paramamosain

續表1

NMR信號的歸屬依據參考文獻[23-24]及二維譜提供的氫氫相關和氫碳相關信息確定，NMR譜圖及代謝物NMR信息如圖1、表1所示。結果表明，擬穴青蟹肌肉和肝胰腺的營養物質組成較類似，均含有相同種類的氨基酸、有機酸以及膽堿-O-硫酸、葡萄糖和2-吡啶甲醇。但這2 種組織仍有其特征性營養物質信號，如海藻糖、延胡索酸、甲酸和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）只在肌肉中被檢測到，而肌氨酸、色氨酸和5’-三磷酸尿嘧啶（uridine 5’-triphosphate，UTP）只在肝胰腺中被檢測到。這種物質組成的差異可能與其在組織中的生理功能密切相關。比較NMR譜還可以發現，與硬殼蟹相比，軟殼蟹肌肉含有較低水平的乳酸和5’-單磷酸腺苷（adenosine 5’-monophosphate，AMP），而其肝胰腺則含有較高水平的丙氨酸和較低水平的酪氨酸等。

2.2 軟殼蟹與硬殼蟹的營養物質組成差異

圖2 擬穴青蟹肌肉和肝胰腺提取物的PCA得分圖Fig. 2 PCA scores plots of 1H NMR spectra of the extracts of muscle and hepatopancreas of S. paramamosain

為獲得軟殼蟹與硬殼蟹的營養物質組成差異，首先采用非監督的PCA方法對肌肉和肝胰腺NMR數據的分布進行分析。如圖2所示，組織不同是導致營養物質組成差異的主要原因（圖2A），但蛻殼也導致了肌肉營養物質組成的輕微區分（圖2B）和肝胰腺營養物質組成的明顯區分（圖2C）。

圖3 擬穴青蟹硬殼蟹與軟殼蟹肌肉和肝胰腺提取物的OPLS-DA得分圖和相關系數圖Fig. 3 OPLS-DA scores plots and corresponding color-coded correlation coefficient loadings plots

為進一步提取軟殼蟹與硬殼蟹的物質組成差異，對不同采集時間的軟殼蟹組織的NMR數據與硬殼蟹進行了4 個OPLS-DA模型，如圖3所示，根據模型的Q2值和CV-ANOVA所得的P值，驗證了這些模型都是可靠的。OPLS-DA結果表明，與硬殼蟹相比，0 h采集的軟殼蟹肌肉含有較低含量的乳酸、賴氨酸、精氨酸和三甲胺-N-氧化物（trimethylamine-N-oxide，TMAO）；而其肝胰腺則含有較高含量的亮氨酸和丙氨酸，同時含有較低含量的谷氨酸、甘氨酸、磷酸膽堿、甜菜堿和UTP。如果未能及時采集軟殼蟹，當采集時間延遲到蛻殼后3 h時，則軟殼蟹肌肉含有更低含量的乳酸、精氨酸、TMAO、AMP和葫蘆巴堿；而肝胰腺中的谷氨酸、甘氨酸、磷酸膽堿和甜菜堿含量仍然低于硬殼蟹，丙氨酸含量仍然高于硬殼蟹，其他營養物質包括組氨酸、酪氨酸、葡萄糖和未知物U1的含量也顯著低于硬殼蟹。

圖4 擬穴青蟹軟殼蟹相對于硬殼蟹的營養物質變化Fig. 4 Variations in nutrients in soft-shell mud crabs relative to hard-shell mud crabs

如圖4所示，軟殼蟹肌肉中的乳酸和AMP含量下降較明顯，而且隨著采集時間的延長而加劇，在蛻殼后3 h時，已分別降低了57.6%和72.3%。而丙氨酸、賴氨酸、精氨酸、焦谷氨酸和葫蘆巴堿含量都降低20%左右。軟殼蟹肝胰腺中產生的營養物質變化要比肌肉更復雜。丙氨酸含量在蛻殼0 h即增加到硬殼蟹的109.0%，在蛻殼3 h更是增加到硬殼蟹的138.7%。相反，谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、葡萄糖和甜菜堿含量都隨著蛻殼時間的延長呈快速降低的趨勢，下降最明顯的是谷氨酰胺，在剛蛻殼后下降了硬殼蟹水平的46.8%，在蛻殼3 h下降了硬殼蟹水平的82.0%。

肌肉組織是擬穴青蟹的主要可食用部位，其營養物質組成差異對青蟹的質量起著主導作用。本研究結果表明，剛剛蛻殼的軟殼蟹肌肉中只有4 種營養物質即乳酸、賴氨酸、精氨酸和TMAO的含量顯著下降，盡管賴氨酸是必需氨基酸，但精氨酸是非必需氨基酸，而且這2 個氨基酸對呈味的影響較小，因此，這2 個氨基酸含量的降低可能對青蟹肌肉的質量影響較小。乳酸呈柔和的酸味[25]，顯著降低的乳酸含量可能只是減少了肌肉的酸味。事實上，在這4 個顯著變化的營養物質中，最值得關注的是TMAO。盡管TMAO對維持海洋生物組織的滲透平衡起著重要作用[26]，但人類食用了含有TMAO的海洋生物如魚類，可能會導致血液中TMAO水平升高[27]，從而提高患動脈粥樣硬化的風險[28]。擬穴青蟹蛻殼后，TMAO含量顯著下降，這可能預示著人們患動脈粥樣硬化的風險會降低，但減少的TMAO可能在細菌或酶的作用下已降解成為有害物質三甲胺（trimethylamine，TMA）[29-30]，因為TMA進入人體肝臟后同樣會被黃素單加氧酶轉化成為TMAO[28]。但本研究并未檢測到TMA，說明TMA在肌肉中的含量低于NMR檢測限或甚至為0，但擬穴青蟹肌肉中TMAO的分解值得以后進一步研究。

盡管肌肉是主要的食用部位，但肝胰腺卻是消費者評價青蟹品質優劣的關鍵，因為消費者的評價依據是肝胰腺的色澤。但在營養學家眼里，客觀的營養物質組成才是食品品質的決定因素。在新蛻殼的青蟹肝胰腺中，顯著提高的有亮氨酸和丙氨酸，顯著下降的有谷氨酸和甘氨酸。亮氨酸是必需氨基酸，丙氨酸、谷氨酸和甘氨酸是非必需氨基酸。從滋味角度，丙氨酸和甘氨酸帶有甜味，谷氨酸呈鮮味，而亮氨酸呈苦味[25]。這些氨基酸含量的波動加上顯著降低的甜菜堿含量可能會影響軟殼蟹肝胰腺的最終滋味。

如果擬穴青蟹蛻殼后未能及時采集，肌肉和肝胰腺的營養物質組成變化將進一步加劇。肌肉中有5 種營養物質即乳酸、精氨酸、TMAO、AMP和葫蘆巴堿的含量顯著降低，其中，AMP可賦予肌肉鮮味[25,31]，降低的AMP含量可能影響軟殼蟹肌肉的鮮度。與肌肉相比，延遲采集對肝胰腺營養物質的影響更大，有更多的營養物質如組氨酸、酪氨酸和葡萄糖含量均顯著降低，組氨酸、酪氨酸呈苦味，但葡萄糖提供甜味，更重要的是這些物質都是人體重要的營養物質。因此，延遲采集將可能影響擬穴青蟹軟殼蟹的品質和風味。

3 結 論

本研究利用基于NMR的代謝組學技術，比較分析擬穴青蟹軟殼蟹與硬殼蟹之間的小分子營養物質組成差異。與硬殼蟹相比，剛蛻殼的軟殼蟹肌肉中只有賴氨酸、精氨酸、乳酸和TMAO含量發生了顯著下降，可能對軟殼蟹肌肉的營養價值和口感影響較小，但TMAO含量的顯著下降可能降低了人們患病的風險；同時，在剛蛻殼的軟殼蟹肝胰腺中，4 種氨基酸和甜菜堿含量的顯著波動可能影響了肝胰腺的滋味。如果擬穴青蟹蛻殼后未能及時采集，蛻殼后3 h的軟殼蟹肌肉和肝胰腺的營養物質組成變化將進一步加劇。特別是軟殼蟹肌肉中的AMP水平開始呈顯著下降，這可能影響肌肉的鮮度；而肝胰腺中的組氨酸、酪氨酸和葡萄糖含量也開始呈顯著降低，可能影響肝胰腺的營養價值。因此，從小分子營養物質水平來看，剛蛻殼的擬穴青蟹軟殼蟹可比擬于硬殼蟹，而且可能是一種更健康的水產品，但延遲采集軟殼蟹將會影響青蟹軟殼蟹的品質和口感。本研究結果可為擬穴青蟹軟殼蟹的采集和質量評價提供參考。