TP-M13-SSR技術在麥芽品種鑒定中的應用

張志軍，黃克興，岳 杰，劉明麗，祁明霞，董建軍*

（啤酒生物發酵工程國家重點實驗室，青島啤酒股份有限公司，山東 青島 266100）

啤酒是以麥芽、酒花、水為主要原料，經酵母發酵作用釀制而成的飽含二氧化碳且乙醇體積分數較低的酒。麥芽作為啤酒的主要原料，是大麥經浸麥、發芽、干燥和焙焦等工藝制得的，不同品種麥芽的釀造特性和啤酒風味存在一定差異，釀造工藝需要根據麥芽品種的特點進行相應調整。現有的麥芽質量參數如浸出率、糖化力、庫爾巴哈值等均是反映麥芽混合狀態下的平均值，非單粒麥芽質量參數，通過常規質量指標無法對現有麥芽品種進行區分。因此麥芽品種鑒定是評價麥芽質量的重要指標，也是多年來啤酒企業一直迫切希望解決的難題。

目前，大麥品種鑒定技術包括形態鑒別法、蛋白質電泳鑒別法和DNA分子標記法等。Draper[1]利用醇溶蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳進行大麥品種真實性和品種純度的鑒定。林艷等[2]利用Gel-Pro軟件對大麥蛋白電泳圖譜進行條帶分析和比較，建立了每個品種的蛋白質“指紋”，組成加拿大啤酒大麥品種標準圖譜庫，但該法存在分辨率低、鑒定結果不夠準確的問題[3]。游麗華等[4]利用蛋白質組學技術建立澳大利亞啤酒大麥醇溶蛋白標準圖譜。Scobie等[5]利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜分析西澳種植大麥蛋白質圖譜進行品種的快速鑒定。然而大麥經發芽、干燥等制麥工藝后外觀特征已發生變化，且醇溶蛋白在蛋白酶的作用下分解，因此大麥蛋白電泳法已不適用于麥芽品種的鑒定。與從大麥葉片中提取DNA相比，麥芽中富含多糖、多酚、氨基酸等物質，DNA分離純化難度更大。更為關鍵的是麥芽經84～86 ℃高溫焙焦2～3 h后DNA鏈容易斷裂和降解[6]，影響聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）的擴增效果。

隨著DNA分子標記技術的開發和利用，DNA指紋圖譜逐漸成為鑒定種子真實性的重要方法。簡單序列重復（simple sequence repeat，SSR），又稱微衛星，是一類由1～5 個核苷酸為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯重復序列[7]。作為第2代分子標記技術，SSR標記具有高多態性、重復性、穩定性等優點，廣泛應用于植物種質資源鑒定及親緣關系等方面的研究，包括大麥[8-13]、小麥[14-17]等。谷方紅等[6]從46 對SSR引物中篩選到5 個多態性較豐富的引物，可區分實驗的8 個大麥及麥芽品種。Lin Yan等[18]利用SSR分子標記進行大麥品種鑒定，基于4 對SSR引物建立17 種大麥品種的等位基因檢索系統。Amani等[19]利用11 個SSR標記對31 個北非六棱大麥品種的遺傳多樣性進行分析。常規的SSR操作是利用聚丙烯酰胺凝膠電泳配合硝酸銀染色進行基因多態性分析，該技術存在難以準確讀取擴增片段大小、分辨率低等缺點[20]。與常規的凝膠電泳檢測法相比，基于DNA測序儀的SSR熒光標記毛細管電泳可以得到目標DNA片段的準確大小，檢測結果更為精確，適用于大批量樣品的檢測分析，具有高靈敏度、高分辨率、快速、自動化、應用范圍廣等優點。毛細管電泳是以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，依據樣品中各組分之間的淌度和分配行為上的差異而實現分離的電泳分離分析方法。毛細管電泳在檢測時要求引物必須攜帶熒光檢測器能識別的熒光染料，熒光檢測器對標記有熒光染料的擴增產物進行信號采集，通過與各泳道的分子質量內標進行比對，可自動讀取產物片段大小。在進行SSR引物初篩時需要檢測的引物數量較多，由于每對引物都需要進行熒光標記，因此這種方法的引物合成成本較高。

TP-M13-SSR（simple sequence repeat with tailed primer M13）是基于熒光測序技術的SSR擴增產物檢測體系，該法將M13序列作為通用接頭引入SSR熒光測序鑒定中，在不同SSR標記進行檢測時均可使用，熒光引物成本大幅降低，因此是一種高通量低成本的分析技術。實驗中需要增加新的引物進行分析時，合成常規引物即可，不用再合成熒光引物，因此實驗成本大幅降低。此技術廣泛應用于植物種質資源鑒定及親緣關系等方面的研究，已在高粱、玉米、蘋果等植物的品種鑒定上得到應用[21-25]。

本研究采用TP-M13-SSR分子標記技術，對國內主要使用麥芽品種的等位基因差異性進行研究，篩選多態性引物，構建23 種麥芽品種DNA指紋數據庫，為啤酒企業采購商業麥芽提供可靠的品種鑒定手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇23 個國內常用的啤酒大麥品種進行研究，包括5 個加拿大大麥、11 個澳大利亞大麥、3 個法國大麥和4 個國產大麥，品種名稱及來源見表1，其中加麥Copeland和Metcalfe，澳麥Scope、Bass和Commander，法麥Sebastian是國內最常用的進口大麥品種。對上述大麥品種進行微型制麥，得到相應的麥芽樣品。制麥條件參考青島啤酒微麥工藝，14 ℃浸麥44 h，15 ℃發芽4 d，45～70 ℃干燥5 h，84 ℃焙焦3 h，冷卻后去根處理，4 ℃保存備用。

植物DNA試劑盒（DNeasy plant mini kit 69104） 德國Qiagen公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs 美國Thermo Fisher公司；GeXP試劑 美國Beckman Coulter公司；引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

表1 大麥品種及產地Table 1 List of barley cultivars used in this study

1.2 儀器與設備

C1000 Touch? PCR儀、PAC3000型電泳儀 美國Bio-Rad公司；1-15離心機 德國Sigma公司；CK1000D高通量組織研磨儀 北京托摩根公司；GenomeLab?GeXP遺傳分析系統 美國Beckman Coulter公司；Ultrospec2100紫外分光光度計 美國GE公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品DNA的提取

取單粒麥芽樣品于2.0 mL離心管中，加入8 mm鋼珠一顆，高通量組織研磨儀1200 r/min粉碎1 min，利用Qiagen植物DNA試劑盒進行提取。提取的DNA用100 μL超純水或TE溶解，并用2%瓊脂糖電泳和紫外分光光度計測定所提DNA的純度與質量濃度。將所提DNA質量濃度稀釋到20 ng/μL，置于－20 ℃保存備用。

1.3.2 SSR引物合成

第1條引物是SSR正向引物的5’端和M13引物相連合成帶有M13尾巴的引物，即TP-M13引物；第2條引物為正常的SSR反向引物；第3條引物是5’端標記有Alexa Fluor 750熒光的M13通用引物。所述M13通用引物的引物序列為TGTAAAACGACGGCCAGT。

1.3.3 反應條件

PCR體系反應體積為20 μL，含MgCl22.5 mmol/L，dNTP 0.20 mmol/L，帶有M13尾巴序列的特異正向引物0.04 μmol/L、反向引物0.16 μmol/L，M13熒光引物0.12 μmol/L，Taq DNA聚合酶0.5 U，2×PCR緩沖液（不含Mg2+），樣品DNA 10～50 ng。反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3.4 產物分離

制備甲酰胺上樣緩沖液（sample loading solution，SLS）-DNA分子質量內標（DNA size standard kit，DSS）混合液：取0.5 μL的DSS-400，加入39.5 μL的SLS，渦旋振蕩器上混合均勻，加入樣品板中。PCR產物稀釋處理，樣品孔中加入稀釋后的PCR產物1 μL，加1 滴石蠟油覆蓋樣品；在緩沖液板內加入3/4體積的分離緩沖液。將上樣板和緩沖板放入GenomeLab? GeXP遺傳分析系統儀中，進樣電壓2.0 kV，時間30 s；90 ℃變性120 s；分離電壓6.0 kV，時間35 min。在毛細管凝膠電泳過程中，PCR產物與DSS-400分子質量內標的熒光信號均由基因分析儀自動保存。

1.3.5 數據分析和指紋圖譜構建

用GeneMapper-V3.0軟件對GeXP遺傳分析系統儀收集到的數據進行分析，通過人工分析與軟件統計得出不同麥芽的SSR標記片段。利用軟件將SSR標記片段與DSS-400分子質量內標比較，得到SSR標記片段長度大小。

1.4 數據處理

根據麥芽樣品擴增片段的毛細管電泳圖譜，將檢測峰判讀為對應的等位基因，純合位點的等位基因記錄為X，雜合位點的等位基因記錄為X/Y，其中X、Y為該位點上2 個不同的等位基因片段大小，小片段在前，大片段在后。采用1～9的個位數字和26 個英文字母的組合對檢測峰進行編碼，數字代表引物順序，字母代表等位基因編碼，每對引物都有對應的數字和字母組合便于快速識別。對一個給定的SSR引物，不同的品種會同時存在幾個等位基因，根據等位基因的大小進行排序，最小的定為a，然后根據分子質量的大小依次定位為b、c、d等[26]，從而構建麥芽品種的標準指紋圖譜。

2 結果與分析

2.1 多態性引物篩選

根據相關報道[27-29]，從大麥7 條染色體中選擇163 對SSR引物，以8 個麥芽品種的DNA為模板，每對引物至少重復實驗3 次，選擇多態性好的引物作為初篩引物。利用23 個麥芽品種對初篩引物進行二次篩選，最終得到4 對穩定性好、重復性好、PCR穩定的SSR引物，見表2。

表2 引物序列信息及染色體位置Table 2 Primer sequences and their chromosome locations

2.2 SSR引物多態性分析

利用篩選出的4 對SSR引物對23 個麥芽品種進行PCR擴增，獲得不同品種在各等位基因上的片段，從毛細管凝膠電泳圖譜中選擇擴增產物清晰、重復性好的檢測峰作為等位基因位點用于品種多樣性分析。結果表明，4 對引物共檢測出27 個等位基因，每對引物的等位基因為3～10 個不等，平均每個引物產生6.75 個等位基因，多態性良好。其中位點HVM68多態性最豐富，在183～313 bp之間包括10 個等位基因；位點HVWAXYG多態性其次，在185～222 bp之間含有9 個等位基因；位點EBmac755在144～159 bp之間含有5 個等位基因；位點Scssr10148多態性最低，在199～241 bp僅含有3 個等位基因。擴增產物片段大小的差異可以用于麥芽品種的區分，引物擴增片段的等位基因數越多，越能反映不同品種的差異。

2.3 麥芽品種SSR指紋圖譜的建立

圖1 Copeland（A）和Baudin（B）在4 個SSR位點的TP-M13-SSR指紋圖譜Fig. 1 TP-M13-SSR fingerprinting of Copeland (A) and Baudin (B) at 4 SSR loci

利用4 對引物的組合構建全部23 個麥芽品種的TPM13-SSR指紋圖譜。每個品種在不同引物下的擴增產物在毛細管電泳上進行分離后，根據電泳圖譜上的峰值變化將主要檢測峰判讀為對應的等位基因，綜合擴增產物的電泳圖譜和等位基因大小，就構成了每個麥芽品種的SSR指紋圖譜，作為麥芽品種間區分的判定依據。如圖1所示，對全部麥芽品種的電泳圖譜進行比較，發現每一個麥芽品種在4 對引物下都有自己獨特的指紋圖譜組合，因此通過指紋圖譜可實現不同麥芽品種的有效區分。

表3 23 種麥芽在4 個SSR位點的標準指紋數據Table 3 Standard fingerprint data of 23 varieties of malt at 4 SSR loci

根據每個麥芽品種在4 個位點上等位基因差異的變化，按照引物順序建立23 個麥芽品種的指紋數據，如表3所示。不同麥芽品種間等位基因之間差異大小不等，加麥Copeland和澳麥Baudin在4 對引物中等位基因大小均不相同，二者差異明顯，易于區分；而同為加麥的Copeland和Metcalfe二者在引物Scssr10148、HVWAXYG和EBmac755上等位基因大小完全一致，只在引物HVM68才有差異，說明2 個品種比較接近區分難度較大。

2.4 麥芽品種的區分

表4 23 種麥芽在4 個SSR位點的的SSR標準指紋編碼Table 4 SSR standard fingerprint coding of 23 varieties of malt at 4 SSR loci

根據SSR指紋圖譜，將每對引物擴增的條帶按照從小到大的順序排列，依次編碼[30]。本研究利用4 對多態性豐富的SSR引物可準確鑒別的23 個麥芽品種，各麥芽品種的特征指紋代碼見表4。按照固定引物順序將每個品種指紋圖譜所對應的編碼按特定的引物順序排列起來，就構成了代表各品種身份的特征指紋代碼，4 對引物下加麥Copeland指紋代碼為1h2g3d4c，澳麥Gairdner的指紋代碼為1a2e3e4c。如檢測某未知麥芽樣品，可先用4 對特定引物對待測麥芽樣品進行PCR擴增和毛細管電泳檢測，將等位基因型所對應的代碼按引物順序排列起來，與標準麥芽的指紋代碼進行比對，即可直觀地判定出待測樣品是否是目標品種，從而實現麥芽品種真實性的判斷。采用1～9的個位數字和26 個英文字母的組合對檢測峰進行編碼，每對引物都有對應的數字和字母組合便于快速識別，避免了僅使用數字編碼時因等位基因過多需要兩位數字進行編碼的情況。

表5 23 種麥芽品種區分的等位基因組合Table 5 Allele combinations for identification of 23 malt varieties

如表5所示，23 個麥芽品種中4 對引物可單獨區分的品種為0～5 個不等，HVM68可直接區分5 個品種，HVWAXYG可區分3 個品種，Scssr10148和EBmac755可區分0 個品種。引物間相互組合提高可區分品種數量，進而確定引物的最佳組合。兩引物組合中HVM68和HVWAXYG組合可實現17 個品種的區分，區分率最高，為73.9%；引物Scssr10148和EBmac755組合可實現6 個品種的區分，區分率最低，為26.1%。可根據兩引物組合的結果繼續增加引物數量，提高品種的區分能力。在HVM68和HVWAXYG組合基礎上，增加EBmac755可實現23 個麥芽品種的全部區分，區分率為100%，該組合為最佳引物組合。因此僅需要3 對核心引物（HVM68、HVWAXYG和EBmac755）的組合即可實現全部23 個麥芽品種的區分。未來隨著麥芽品種數量的增加，某些品種間的指紋圖譜可能完全相同，4 對引物組合的鑒定能力可能會逐漸降低，可通過增加新的多態性引物提高引物組合的區分能力。

3 結 論

常用的SSR分析是利用聚丙烯酰胺凝膠電泳結合銀染進行片段多態性分析，該法靈敏度和分辨率較低，不能準確量化擴增片段的大小，無法在不同凝膠圖譜之間進行橫向比較。基于DNA測序儀的SSR熒光標記毛細管電泳可以得到目標DNA片段的準確大小，具有高靈敏度、高分辨率、快速、自動化、應用范圍廣等優點。TPM13-SSR技術是SSR技術與熒光自動測序技術的完美整合，在大批量引物篩選的情況下，M13通用引物可大大降低SSR引物熒光標記的成本，方法簡便可靠，適用于麥芽品種指紋圖譜的構建。本研究從163 對SSR引物中篩選到4 對多態性豐富的SSR引物，每對引物的等位基因為3～10 個不等，平均每個引物產生6.75 個等位基因。利用4 對SSR引物構建23 個麥芽品種的指紋圖譜及對應的數據庫，僅需3 對核心引物即可實現全部麥芽品種的區分，該法檢測成本低，方法準確可靠，可實現國內啤酒行業常用麥芽品種的真實性鑒定，從源頭上保障啤酒原料的品質，為啤酒企業在麥芽采購環節提供技術支持。