13 種河豚魚CO I基因部分DNA序列分析及在物種鑒定中的應用

陳文炳，繆婷玉，翁國柱，陳融斌，邵碧英，彭 娟，江樹勛

（1.福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，福建 福州 350001；2.莆田出入境檢驗檢疫局，福建 莆田 351100；3.集美大學水產學院，福建 廈門 361021）

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增技術在食品動物成分鑒別中已得到廣泛應用[1-4]，早期DNA條形碼是指通過PCR擴增與測序獲得的長度適當的線粒體細胞色素C氧化酶亞基I（mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I，CO I）基因的DNA片段[5]，其間堿基序列在物種間遺傳變異較大，而在種內遺傳變異小，相對穩定。近年來，被作為DNA條形碼的不僅限于CO I基因，包括基于16S rRNA和線粒體細胞色素b（cytochrome b，Cyt b）基因的DNA條形碼，都已被廣泛應用于魚類物種鑒別[6-18]。在河豚魚物種分化分子生物學研究領域，陳超等[19]應用隨機擴增多態性DNA（random amplification of polymorphic DNA，RAPD）標記技術對4種東方鲀屬河豚魚進行系統關系的研究分析。邵愛華等[20-24]以暗紋東方鲀（Takifugu fasciatus）為研究材料，對16S rRNA基因、Cyt b基因及CO I、CO II、CO III 3 種亞基等進行了一系列的序列分析研究。本課題組前期建立并優化了河豚魚物種成分的PCR檢測方法[25]，以及對河豚魚的Cyt b與16S rRNA的靶基因序列進行同源性分析[26-27]，探討物種間的親緣關系，并對基于芯片生物分析系統[28]與限制性內切酶確證河豚魚物種成分PCR檢測結果等進行了一系列探討[29]。

本實驗利用13 個已知物種名稱的河豚魚CO I基因靶序列進行序列同源性比對分析，建立樣品間的系統關系樹，并將9 個未知種名的河豚魚樣品與13 個已知物種名稱的CO I基因靶序列進行同源性比對分析，為基于CO I基因的DNA條形碼技術在河豚魚物種鑒定中的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

表1 22 個河豚魚供試樣品Table 1 Twenty two samples of puffer fishes tested in this study

已知物種名稱的河豚魚樣品11 個來自福建莆田、廈門等水產養殖場，2 個來自福建省集美大學水產學院近海捕撈；5 個未知物種河豚魚干樣品來自福建福州沿海，4 個未知物種新鮮個體來自海南省（表1）。

十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB） 上海博亞生物技術有限公司；2×Taq PCR Master Mix、蛋白酶K、DNA Marker I 天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖 英國Oxoid公司；CO I基因PCR擴增通用引物根據文獻[30]進行序列修改，正向CO I A：5’-GGCGTATGCGTCTGGGTAGTC-3’，反向CO I F：5’-CCTGCAGGAGGAGGAGATCC-3’，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設備

Ultrospec 1100 pro核酸蛋白分析儀 瑞典Amersham公司；T-Gradient梯度PCR儀 德國Biometra公司；Power Pac 1000電泳儀 美國Bio-Rad公司； GL212 PRO凝膠成像儀 美國Carestream公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取與PCR擴增

DNA提取方法與PCR擴增參照文獻[25]。取鮮肉或干樣50 mg加入CTAB裂解液后在超聲波環境中65 ℃溫育處理30 min，進行DNA提取、PCR產物電泳，并拍照保存。

1.3.2 DNA堿基序列測定、比對、同源性分析

PCR擴增產物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，DNA序列用DNAMAN V6分析軟件進行整理分析，以.seq格式輸出，并對各個樣品的DNA序列進行比對與同源性分析，比對結果以MASED Document/DNAMAN1格式輸出。

2 結果與分析

2.1 CO I基因序列分析與比對

表2 河豚魚的CO I基因PCR產物堿基序列的基本信息Table 2 Information about partial sequences of the CO I gene from puffer fish

對CO I基因PCR擴增引物進行擴增，獲得的PCR產物進行測序，片段大小為681 bp，堿基序列基本信息與基因庫（GenBank）登錄號見表2。堿基序列同源性分析結果表明，13 個已知種名的河豚魚樣品堿基序列差別主要表現在單個堿基的置換。

2.2 序列同源性分析

圖1 13 個已知種名河豚魚的CO I部分基因PCR產物堿基序列同源樹Fig. 1 Phylogenetic tree based on CO I sequence homology among 13 known species

13 個已知種名的河豚魚樣品間同源率為84%～100%（圖1），可歸為4組，第I組含兔頭鲀屬的黑腮兔頭鲀與兔頭鲀2個種及蟲紋東方鲀，同源率為100%；第II組月腹刺鲀，與第I組同源率87%，第III組含腹刺鲀屬的棕斑腹刺鲀、暗鰭腹刺鲀2 個種，同源率為90%，與I組、II組間同源率86%，第IV組含東方鲀屬的7個種，同源率在95%～100%之間。CO I部分基因PCR產物堿基序列同源性分析結果，除蟲紋東方鲀歸到兔頭鲀屬外，其他物種劃分與形態學物種分類較為吻合，但是，物種間同源率達到100%，不利于作為物種鑒別的指標，因此有必要通過其他基因作為輔助組合，加以判斷。

2.3 未知種名河豚魚樣品的種屬

CO I基因部分片段的PCR產物序列同源性聚類分析結果顯示（圖2），包括9 個未知種名的樣品，22 個供試樣品可分為4 個組，其中9 個未知種名的樣品被歸類到3 個類群組中，分別屬于東方鲀屬和腹刺鲀屬2 個屬。無未知種名樣品歸到I組；HNW2歸到II組，與月腹刺鲀同源率100%；HNW3、HNW4、FJW2、FJW5、HNW1共5個樣品歸到第III組（腹刺鲀屬），其中HNW3、HNW4、FJW2、FJW5與棕斑腹刺鲀同源率為100%，HNW1與暗鰭腹刺鲀同源率100%；FJW1、FJW3、FJW4 3個樣品歸到第IV組，與橫紋東方鲀同源率均為100%。

根據上述分析結果判定，9 個未知種名的樣品中，1 個樣品（HNW2）為月腹刺鲀，4 個樣品（HNW3、HNW4、FJW2、FJW5）為棕斑腹刺鲀，1 個樣品（HNW1）為暗鰭腹刺鲀，3 個樣品（FJW1、FJW3、FJW4）為橫紋東方鲀。該結果與筆者基于同樣河豚魚13 個樣品的Cyt b基因部分序列（使用的XBssb引物[31]：正向：5’-GGCGTGAAAAACCATCGTTG-3’，反向：5’-CCCCGACATTCGGTTTACAAGAC-3’）聚類分析結果（未發表）高度吻合（圖3），圖3中除FJW2樣品與棕斑腹刺鲀同源率為96%以外，其他8個樣品歸類結果與本實驗聚類分析結果（圖2）完全一致。

圖2 已知種名與未知種名河豚魚的CO I部分基因PCR產物堿基序列同源樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on CO I sequence homology between known and unknown species

圖3 13 個已知種名與9 個未知種名的河豚魚樣品Cyt b（XBssb引物）部分基因PCR產物序列同源樹Fig. 3 Phylogenetic tree based on Cyt b sequence (using XBssb primers)homology between known and unknown species

3 結論與討論

本實驗獲得的3 屬13 種河豚魚樣品的CO I基因部分片段DNA堿基序列共13 條，提交GenBank，取得相應的登錄號（表2）。探討了CO I基因部分序列的DNA條形碼技術在河豚魚種屬鑒別中應用的可能性。根據DNA條形碼序列聚類分析，判定了9 個未知種名的河豚魚樣品所屬的物種，其中，HNW2為月腹刺鲀，HNW3、HNW4、FJW2、FJW5均為棕斑腹刺鲀，HNW1為暗鰭腹刺鲀，FJW1、FJW3、FJW4為橫紋東方鲀。該結果在XBssb引物[23]對同樣河豚魚樣品的Cyt b基因部分序列進行PCR擴增獲得的序列聚類分析結果（圖3）中得到驗證。另外，本實驗對已知種屬的樣品分類與未知樣品的種屬判定結果也比筆者之前基于另一個Cyt b基因片段部分DNA序列[26]及16S rRNA基因部分DNA序列的分類結果[27]更接近形態學分類、更合理。可見本實驗選擇的CO I基因的DNA片段序列是比較理想的河豚魚物種歸類的鑒定指標，可以用于河豚魚種屬鑒定。13號樣品蟲紋東方鲀在16S rRNA[27]、Cyt b基因（圖3）及本研究CO I基因的DNA片段序列的同源性聚類分析結果，都是與兔頭鲀屬歸為一組，且同源率達99%～100%，可能形態學分類上存在誤差，此問題有待進一步探討。