高通量測序方法研究傳統四川泡菜母水中微生物群落的動態變化

李 恒，陳 功，伍亞龍，鄧維琴，張 偉，朱 翔，王 勇，張其圣,*

（1.四川東坡中國泡菜產業技術研究院，四川 眉山 620030；2.四川省食品發酵工業研究設計院，四川 成都 611130）

泡菜是一種具有獨特風味和口感的傳統發酵蔬菜制品，歷史悠久，源遠流長，距今已有三千多年的歷史。我國泡菜工藝多樣，產品種類極為豐富，其中尤以四川泡菜最為出名。傳統四川泡菜是以新鮮蔬菜為原料，經乳酸菌為主導的微生物發酵而成，因富含活性乳酸菌、發酵副產物等健康元素，越來越得到消費者的青睞[1-4]。“母水發酵”是傳統四川泡菜最具特色的制備工藝之一。泡菜母水即傳統四川泡菜泡漬發酵時的鹽水，經過不斷取出和投加蔬菜及輔料進行泡制。泡菜母水中存在大量的乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等活性微生物，同時，蔬菜的發酵也賦予了泡菜母水豐富的有機酸、游離氨基酸、醛類、酮類、酯類等風味物質[5-9]。

國內外學者研究發現泡菜中乳酸菌和酵母菌是優勢菌群，乳酸菌在發酵過程中起主導作用。泡菜發酵過程中優勢乳酸菌有糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、乳酸球菌（Lactococcus lactis subsp.）、明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides subsp.）、Mesenteroides、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）和玉米乳桿菌（Lactobacillus zeae）等[6-7,10]。家庭制作泡菜中酵母菌有熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）、漢森德比利酵母、Kazachstania unispora等[11]。泡菜中的微生物種類和數量極多，但其種群與構成并不是一成不變的，在不同的發酵時期微生物種群和構成有一定的差異。傳統四川泡菜采用“母水發酵”工藝，母水的形成與泡菜體系中微生物及其代謝產物有密切的關系[12-13]。目前已有報道多是針對泡菜本身或者泡菜母水中微生物含量[2,14-16]的研究，而針對不同發酵代數泡菜母水中微生物種類及動態變化的研究還鮮見報道。研究傳統四川泡菜母水中微生物隨不同發酵代數泡菜的動態變化對研究四川泡菜的安全性、風味物質、營養物質的形成具有重要意義，可作為促進四川傳統泡菜工業化生產的重要依據。

可培養方法是傳統發酵食品體系中微生物最常見的研究方法，但采用可培養方法得到的微生物信息非常有限，對微生物世界的認識存在片面性，存在較大的局限性。近年來，高通量測序技術的快速發展為解析復雜的微生物體系提供了一種有效、便捷的方法。其通量高、準確率高、可同時獲得微生物群落中的全部微生物定性及相對定量的遺傳信息等特點，被廣泛用于傳統發酵食品微生物體系的研究[17-18]。目前高通量測序已被廣泛用于奶酪、白酒、泡菜等發酵食品中微生物多樣性的研究[19-22]。本研究采用高通量測序技術對傳統四川泡菜母水（20 代泡菜）中細菌和真菌群落的動態變化進行研究，解析不同代數發酵泡菜母水中的主要微生物群落構成，揭示泡菜母水在不同蔬菜發酵代數的微生物群落動態變化規律及其穩態結構的形成，為傳統四川泡菜的多次數發酵泡菜風味及品質評價提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮花白、白蘿卜、胡蘿卜、生姜、辣椒、花椒眉山當地菜市場；無碘食用鹽 四川省鹽業公司；陶制泡菜壇 眉山當地市場。

無水乙醇（96%～100%） 成都市科龍化工有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA回收試劑盒天根生化科技（北京）有限公司；OMEGA真菌DNA提取試劑盒 美國BioTek公司；MRS培養基、孟加拉紅培養基、PDA培養基 北京陸橋技術有限公司；瓊脂糖北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DW-86W100超低溫冰箱 青島海爾股份有限公司；L6S紫外分光光度計、雷磁pHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；T2002型電子天平 常熟市天量儀器有限責任公司；SHZ-D（III）循環式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋 北京中興偉業儀器有限公司；YM75Z75L不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業有限公司；QL-901旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；SW-CJ-IFD超凈工作臺江蘇蘇凈集團有限公司；純水機 四川優普超純科技有限公司。

圖1 泡菜母水制備示意圖Fig. 1 Schematic representation of pickle brine preparation

1.3 方法

1.3.1 泡菜母水制備

表1 泡菜制備原輔料配比Table 1 Ingredients used for Paocai preparation

泡菜母水的制備方法如圖1所示，原輔料配比如表1所示。泡菜母水的制備步驟為：1）將新鮮蓮花白、白蘿卜、胡蘿卜、生姜、小米辣用清水沖洗干凈，并按照要求進行切分；2）先將處理后的原輔料投入到2.5 L的陶制泡菜壇中，再將食鹽加入到純凈水中溶解并加入到壇內；3）密封后的泡菜壇置于23 ℃條件下進行密封發酵，并及時取樣檢測；4）新鮮疏菜密封發酵5 d后，揭開壇蓋用干凈的玻璃棒輕微攪拌壇內泡菜，再靜置10 min后，于液面下10 cm處四周及中間共5 點取泡菜及母水樣品10 mL混合后待測，此為1代泡菜母水；再向壇內加入新鮮的蓮花白、白蘿卜、胡蘿卜，同時向壇內加入新鮮蔬菜總質量2%的食鹽16 g，密封后置于23 ℃恒溫條件下發酵2 d，繼續取樣，此為2代泡菜；此后每隔2 d取出成熟泡菜與泡菜水，并加入新鮮蔬菜進行下一代泡制，如此不斷重復，連續泡菜20 代；5）泡菜壇內生姜與辣椒在泡漬發酵5 代后更換相同質量的新鮮生姜、辣椒和花椒，即在第5、10、15、20代時將壇內的泡生姜、泡辣椒和花椒取出，加入相同質量的新鮮生姜、辣椒和花椒，同時加入新鮮生姜和辣椒總質量2%的食鹽。

1.3.2 DNA提取和聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增

分別取第1、2、3、5、7、10、12、15、18、20代的泡菜母水，采用細菌基因組DNA提取試劑盒和真菌DNA提取試劑盒分別提取細菌和真菌基因組DNA，采用核酸蛋白微量檢測儀檢測DNA的濃度和純度，置于－20 ℃備用。

采用338 F-806 R為引物擴增細菌16S DNA V3-V4區序列，采用ITS1 F-2043 R為引物擴增真菌ITS區序列。采用天根瓊脂糖DNA回收試劑盒對PCR擴增產物進行切膠回收，然后按照PCR產物的檢測方法檢測。

1.3.3 高通量測序

將PCR擴增產物送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行MiSeq測序，按照97%相似性對非重復序列（不含單序列）進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，得到OTU的代表序列，將所有優化序列map至OTU代表序列，選出與OTU代表序列相似性在97%以上的序列，最后采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并在各個水平統計每個樣品的群落組成。16S細菌使用Silva數據庫，ITS真菌使用Unite的真菌數據庫進行比對。

2 結果與分析

2.1 泡菜母水中的細菌多樣性結果分析

利用MiSeq測序方法對第1、2、3、5、7、10、12、15、18、20代泡菜母水的10 個樣品進行分析，共得到961 752 條序列，平均序列長度449.34 bp。其中421～440 bp的序列占2.84%；441～460 bp的序列占97.16%。本次測序的目標序列是V3-V4，說明測序長度正確。

圖2 泡菜母水細菌在門（A）和屬（B）水平上的相對含量Fig. 2 Relative abundance of bacteria in Paocai brine at the phylum (A) and genus (B) levels

對優化序列提取非重復序列，按照97%相似性對非重復序列（不含單序列）進行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列。將所有優化序列map至OTU代表序列，選出與OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。961 752 條序列經過上述處理，共劃分得到81個OTU分類。

泡菜母水中細菌在門和屬水平上的相對含量分布結果如圖2所示，其細菌分屬7個門，分別為Firmicutes、Proteobacteria、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、梭菌門（Fusobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和藍藻門（Cyanophyta）。Firmicutes是泡菜中最常見的細菌類群，含有19 個OTU，占OTU總數量的23.46%；包含有效序列896 313 條，占總有效序列的94.64%。Proteobacteria在泡菜菌群中占46個OTU，占OTU總數量的56.79%；包含有效序列25 787條，占總有效序列的2.73%。其他5個菌門的序列占細菌總有效序列的比例均很低，分別為Bacteroidetes 0.025%、Actinobacteria 0.001 4%、Fusobacteria 0.002 3%、Chloroflexi 0.001 2%、Cyanophyta 2.61%。與Liang Huipeng等[5]以聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCRDGGE）結合熒光定量核酸（real-time quantitative PCR，qPCR）擴增檢測系統為手段分析的泡菜微生物菌群結構（僅發現Firmicutes和Proteobacteria 2 個門的細菌）相比，本研究結果準確、全面地揭示了四川泡菜中的細菌菌群結構，進一步表明高通量測序手段在微生物群落結構分析方面的優勢[23]。

從屬水平來看，泡菜母水中含量在0.1%以上的細菌屬有7 個，包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、拉烏爾菌屬（Raoultella）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、乳球菌屬（Lactococcus）、藍藻細菌屬（Cyanobacteria_norank）、腸桿菌屬（Enterobacter）和未鑒定到屬（Enterobacteriaceae_unclassifi）。其中Lactobacillus是泡菜母水中的主要細菌屬，包含3 個OTU，占OTU總數的3.70%，但包含有效序列904 029 條，占總有效序列的93.89%；Cyanobacteria_norank包含1 個OTU，占OTU總數的1.23%，包含有效序列255 210 條，占總有效序列的2.65%；Raoultella包含1 個OTU，占OTU總數的1.23%，包含有效序列8 022 條，占總有效序列的0.83%；Citrobacter包含1 個OTU，占OTU總數的1.23%，包含有效序列6 785 條，占總有效序列的0.70%；Lactococcus包含2 個OTU，占OTU總數的2.46%，包含有效序列5 399 條，占總有效序列的0.56%。除此之外，還包括Enterobacter、Enterobacteriaceae_unclassifi、Pseudomonas、Leuconostoc、Enterococcus、Acinetobacter等菌屬，但相對含量均不足0.1%。Lactobacillus在整個泡菜發酵過程中均為優勢菌，這種細菌因其益生作用被廣泛用作各類食品的發酵劑[5,24-26]；最近有報道顯示，Raoultella在廣元酸菜中也有檢出[27]；Citrobacter和Lactococcus細菌在發酵蔬菜研究中常被檢出，Lactococcus對發酵乳的酸化及風味的產生貢獻較大，其對于泡菜的風味形成亦起重要作用[5,28]。

2.2 泡菜母水中的真菌多樣性結果分析

利用Illumina高通量測序平臺對第1、2、3、5、7、10、12、15、18、20代泡菜母水的20個樣品進行分析，共得到514 126 條真菌序列，平均序列長度318.25 bp。其中221～240 bp的序列占2.79%，241～260 bp的序列占1.45%，241～260 bp的序列占95.03%，可以覆蓋目標測序長度。

對優化序列提取非重復序列，按照97%相似性對非重復序列（不含單序列）進行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列。將所有優化序列map至OTU代表序列，選出與OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。514 126 條真菌序列經過上述處理，共劃分得到90 個OTU分類。

圖3 泡菜母水真菌在門（A）和屬（B）水平上的相對含量Fig. 3 Relative abundance of fungi in Paocai brine at the phylum (A) and genus (B) level

圖3 是真菌屬水平和種水平相對含量分布圖，10 個泡菜母水樣本的真菌有效序列被劃分為90 個OTU，包含子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）3 個門和一個未分類的種群。從含量來看，Ascomycota是泡菜母水中的主要真菌類群，含有62 個OTU，占OTU總數的68.89%；包含有效序列512 784 條，占總有效序列的99.93%。Basidiomycota含有18 個OTU，占OTU總數的20%；包含有效序列226條，占總有效序列的比例不足1%。Zygomycota含有OTU 3條，占OTU總數的3.33%，有效序列12 條，占總有效序列的比例不足1%。一個未分類種群含有7 個OTU，占OTU總數的7.78%，含有效序列134 條，占總有效序列的比例不足1%。Liang Huipeng等[5]的研究所檢測出的真菌均屬于Ascomycota，在門水平多樣性其多樣性遠遠小于本研究結果，這可能也是菌群分析方法不同所致，該研究采用的是PCR-DGGE和qPCR的方法，說明本研究采用的高通量測序分析方法更加全面。

從屬水平來看，泡菜母水中的真菌屬主要是Kazachstania和假絲酵母屬（Candida）。其中Kazachstania包含1 個OTU，占OTU總數的1.11%，但包含了498 172 條有效序列，占總有效序列的97.08%；Candida包含7 個OTU，占OTU總數的7.78%，包含14 251 條有效序列，占總有效序列的2.78%。Liang Huipeng等[5]分析的泡菜中畢赤酵母屬（Pichia）和地絲酵母屬（Geotrichum）為主要真菌屬，與本研究結果不同，可能是由于地域、蔬菜原輔料及加工工藝等的差異所致。

2.3 泡菜母水中細菌群落結構的動態變化

圖4 泡菜母水發酵過程中門水平（A）和屬水平（B）細菌群落結構動態變化Fig. 4 Dynamic changes of bacteria community in Paocai brine during fermentation

泡菜母水中的細菌群落包括7 個門，其中Firmicutes和Proteobacteria為優勢菌門。在泡菜母水進化過程中，細菌群落結構在門水平上的動態變化規律如圖4A所示，Firmicutes自始至終都占絕對優勢，而且所占比例呈現緩慢上升趨勢：在1代泡菜母水中Firmicutes所占比例為91.86%，20代時上升至97.05%；Proteobacteria在泡菜母水發酵前期所占比例較高，為7.62%，但隨著泡菜母水的進化其所占比例逐漸減少，直至20代時其含量為1.24%。

在屬水平上，傳統四川泡菜發酵過程中的細菌多樣性呈下降趨勢，各細菌數表現出不同的變化規律（圖4B）。發酵前期泡菜母水中Lactobacillus、Raoultella、Citrobacter、Lactococcus、Cyanobacteria_norank是泡菜母水中的主要細菌屬，Lactobacillus是其中的優勢菌屬，隨著泡菜母水的持續發酵，其含量總體呈現增長趨勢，始終是泡菜母水中的優勢菌屬，在1代泡菜母水中Lactobacillus的比例為90.30%，10代和12代泡菜母水中，其占比上升至96.36%和97.34%，此后略有波動。到20代時其相對含量達到95%以上。此外，Cyanobacteria_norank屬細菌所占比例也逐漸上升，所占比例由0.4%上升到3%。而Raoultella、Citrobacter、Lactococcus、Enterobacteriaceae_unclassifi和Enterobacter等菌屬的占比逐漸下降，最終其總含量不足2%。Raoultella所占比例隨泡菜母水的進化呈逐漸減少趨勢，1代時為2.55%，20代時僅為0.17%。Lactococcus在1～7代時相對含量達到0.5%～1.7%，此后迅速下降至0.1%以下；Enterobacter在1～7代時的相對含量達到0.35%～1%，此后迅速降低至0.06%～0.1%；Enterobacteriaceae_unclassifi在1～7代時的相對含量達到0.1%～1.6%，此后迅速降低至0.1%以下。

2.4 泡菜母水中真菌群落結構的動態變化

圖5 泡菜母水發酵過程中門水平（A）和屬水平（B）真菌群落結構動態變化Fig. 5 Dynamic changes of fungal community in Paocai brine during fermentation at the phylum (A) and genus (B) level

泡菜母水發酵生態系統中的真菌群落結構隨著泡菜母水代數的增加，其多樣性逐漸降低，群落結構也發生改變。泡菜不斷發酵過程中泡菜母水中真菌群落結構的動態變化如圖5所示。從門水平（圖5A）看，Ascomycota從始至終都占據絕對優勢，所占比例達到99%以上，是泡菜母水中的主要真菌群類；此外，還有威克漢姆酵母（Wickerhamomyces）、季也蒙酵母（Meyerozyma）、鐮刀菌屬（Fusarium）、赤霉菌屬（Gibberella）、紅酵母屬（Rhodotorula）、耐冷酵母（Guehomyces）、被孢霉屬（Mortierella）、Basidiomycota、Zygomycota和其他一些未鑒定到門的真菌界微生物，它們所占比例不足1%，不是泡菜發酵過程中的主要真菌群落，相對含量在泡菜母水進化過程中亦沒有明顯的變化規律。從屬水平上看（圖5B），泡菜母水發酵系統中的真菌群落結構隨著泡菜母水代數的增加，其多樣性逐漸降低，群落結構也發生改變。發酵前期的泡菜母水中的真菌以Kazachstania和Candida為主，Kazachstania的比例隨著泡菜發酵代數的增加逐漸升高，1～5代泡菜母水中其所占比例在91%～95%，7代及7代以后的泡菜母水中其所占比例上升至98%～99%；而Candida的比例隨著泡菜發酵代數的增加逐漸降低，1～5代泡菜母水中其所占比例在4%～9%，7代及7代之后的泡菜母水中其所占比例已經低于1%。Liang Huipeng等[5]報道的傳統泡菜發酵1～31 d過程中Pichia始終為優勢真菌屬，而本研究顯示Kazachstania是泡菜母水發酵系統中的優勢真菌。Kazachstania在酸奶[29]、韓國泡菜[30]、日本泡蘿卜[31]等發酵食品中已有報道，本研究首次發現Kazachstania在四川泡菜中作為主要真菌屬，其在泡菜發酵過程中的作用特性有待進一步探索。

發酵前期泡菜母水中微生物多樣性高，細菌和真菌種類較多，發酵后期體系中微生物多樣性降低，但優勢菌群始終不變，且在12代以后泡菜母水中微生物基本保持穩定。整個泡菜體系中優勢菌群主要是Lactobacillus、Cyanobacteria_norank和Kazachstania，說明在不同代數發酵泡菜中起主要作用的微生物是一致的。發酵過程中細菌Raoultella、Enterobacteriaceae_unclassifi、Lactococcus和Enterobacter等菌屬所占比例逐漸降低，最終所占比例不足2%。Cyanobacteria_norank屬細菌所占比例也逐漸上升，所占比例由0.4%上升到3%。真菌體系中Kazachstania最初所占比例為91%，到12代時基本保持穩定，約為99%；而Candida的比例隨著泡菜發酵代數的增加逐漸降低，1～5代泡菜母水中其所占比例在4%～9%，7代及7代之后的泡菜母水中其所占比例已經低于1%，到12代時含量極低。說明泡菜發酵前期微生物多樣性更豐富，隨著發酵代數增多，發酵體系中代謝產物增多，微生物之間競爭可能也更激烈，一些在泡菜體系中適應能力相對較弱的微生物逐漸被淘汰。而適應能力強的主要微生物則在后期發揮主要作用。

2.5 不同發酵階段泡菜母水的微生物群落結構的對比

圖6 基于屬水平的泡菜母水細菌（A）和真菌（B）Heatmap圖Fig. 6 Heatmap analysis of microbiological diversity in Paocai brine

圖7 不同發酵階段泡菜母水中主要細菌（A）和真菌（B）屬相對含量對比Fig. 7 Comparison of the relative contents of major bacteria and fungi in Paocai brine

圖6 顯示，不同發酵階段泡菜母水的細菌群落結構和真菌群落結構有明顯差異，其中7代以前（包含7代）的泡菜母水中細菌菌屬較多，優勢細菌屬主要是Lactobacillus和Cyanobacteria_norank。優勢真菌屬是Kazachstania，5代之后的泡菜母水中微生物真菌菌屬明顯減少，微生物種類多樣性顯著降低。分別根據不同發酵時期泡菜母水細菌和真菌屬水平上群落結構對進行聚類分析，將1、2、3、5代和7代聚為一類，命名為G Earlier；10、12、15、18代和20代聚為一類，命名為G Later，結果如圖7所示。從細菌多樣性來看，G Earlier泡菜母水中的細菌屬明顯多于G Later，其多樣性顯著優于G Later。從細菌群落結構來看，G Later泡菜母水中的Lactobacillus和Cyanobacteria_norank相對含量高于G Earlier，而Raoultella、Citrobacter、Enterobacteriaceae_unclassifi、Lactococcus的相對含量明顯低于G Later，Lactobacillus和Cyanobacteria_norank是泡菜母水中優勢菌屬，且含量逐漸提高。優勢真菌屬主要是Kazachstania，發酵后期泡菜母水中Kazachstania含量略高于發酵前期，Candida和其他真菌的含量明顯低于發酵前期，Kazachstania的含量在整個發酵過程中始終為優勢菌屬。

3 結論與討論

通過分析不同代數泡菜母水中微生物群落的變化，結果顯示，泡菜母水中的細菌群落主要包括7個門，其中Firmicutes和Proteobacteria分別占94.64%和2.73%，為優勢菌門，這和Cao Jialu等[15]的研究一致。Liang Huipeng等[5]研究證明，泡菜中優勢菌門也是Firmicutes和Proteobacteria，說明不同代數發酵泡菜和發酵母水中優勢菌群是一致的；泡菜母水中真菌群落主要包括3個門和1個未分類種群，其中Ascomycota占99.93%，為優勢菌門，Yang Hongyan等[32]的研究結果也證明Ascomycota在泡菜的發酵中有極大的作用。泡菜母水中細菌屬有7個，主要包括Lactobacillus、Raoultella、Citrobacter、Lactococcus等；泡菜母水中的真菌屬主要是Kazachstania，含量超過99%。對不同發酵階段泡菜母水中的微生物群落組成和多樣性的研究發現，隨著發酵代數的增加，泡菜母水中的細菌與真菌多樣性呈下降趨勢，微生物群落構成趨于穩定：Lactobacillus和Cyanobacteria_norank是達到穩態的泡菜母水中的主要細菌屬，Kazachstania是達到穩態的泡菜母水中的主要真菌屬。發酵后期泡菜母水中微生物菌群結構更為穩定，也更單一，其風味相對前幾代泡菜可能更為穩定。不同代數發酵泡菜中風味物質與為微生物菌落結構變化的關系有待進一步研究。

本研究在門水平上的結果與已有研究所報道的微生物菌群呈現出較高一致性，且較全面準確地揭示了傳統四川泡菜的微生物菌群結構。在屬水平上微生物菌群結構與已有報道有所差異，Leuconostoc和Weissella在泡菜體系微生物多樣性分析中[5,32]中多有報道，本研究中卻未見檢出；本研究也首次發現Kazachstania在四川泡菜中作為主要真菌屬，其在泡菜發酵過程中的作用特性有待進一步探索。一般認為真菌與泡菜水中膜的形成、不良氣味的產生、泡菜質地變軟等有關[33]，也有學者認為某些真菌有助于提高泡菜品質，有利于泡菜后熟和芳香物質的形成[30,34]。真菌在四川泡菜中的具體菌群結構、作用特性的相關報道較少，有待進一步探索。