干酪乳桿菌11MZ-5-1發酵酸菜化學成分及細菌多樣性分析

趙 丹，杜仁鵬，宋 剛，孫 健，平文祥，葛菁萍,*

（1.黑龍江大學生命科學學院，微生物黑龍江省高校重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150080；2.黑龍江大學 農業微生物技術教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150500）

酸菜是酸漬大白菜的簡稱，指在低濃度食鹽條件下，經過乳酸發酵而形成的蔬菜發酵制品，是我國東北地區特色傳統發酵食品的典型代表之一[1-2]。酸菜腌制時，原材料不需要滅菌，微生物種群和化學組分多樣，生物因素與非生物因素內部及之間的相互作用十分復雜[3-4]。酸菜發酵體系是一種微生態系統，其中含有乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）、酵母菌、霉菌等多種微生物[5-6]。隨著人們對酸菜的關注和酸菜工業的發展，越來越多的學者對酸菜的微生物菌群進行研究，證實LAB是酸菜發酵系統中的優勢菌種[7-8]。20世紀30年代，Pederson[9]研究了蔬菜發酵過程中微生物，第一次指出了Leuconostoc mesenteroides啟動蔬菜發酵。張魯冀等[10]利用生理生化實驗和16S rDNA測序鑒定法從東北自然酸菜發酵液中分離得到Lactobacillus brevis、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus reuteri。張先琴[11]對四川自然泡菜發酵過程中的菌體多樣性進行研究，發現Lactobacillus是泡菜發酵過程中的優勢菌群，且發酵的過程中存在Pediococcus、Lactococcus以及Aspergillus、Candida albicans等，但真菌的菌群密度較低。

近年來，益生菌LAB在發酵食品中的過程和功能研究日益引人關注。尤其是LAB作為發酵劑參與發酵食品生產過程，如乳制品、豆制品、飲料和腌漬食品等[12]。LAB代謝物特征與發酵食品的口味、香味、結構、顏色以及菌群分布密切相關[13]。不同發酵階段，發酵系統中菌群發生演替，其中以LAB作為發酵劑加入酸菜當中，不僅可以顯著縮短發酵周期，而且能夠降低發酵系統的菌群多樣性，從而為酸菜的風味、品質提供更高的保障[14-15]。Jung等[16]采用核磁共振氫譜結合高通量測序技術，研究L. mesenteroides作為發酵劑，對韓國泡菜發酵過程中微生物菌群和代謝物組的影響，結果表明，Weissella和Lactobacillus是發酵過程中的優勢菌屬，主要風味物質是單糖類的葡萄糖和果糖，有機酸類的乳酸和乙酸。然而很多研究者認為，接種LAB（如：L. plantarum、L. mesenteroides等）發酵酸菜具有發酵時間短、受季節影響小、品質易于控制的特點，但風味不如自然發酵的酸菜自然、醇厚[17]。采用接入發酵劑的方式進行發酵，使其風味逐步接近自然酸菜是大規模生產需要不斷努力的目標。

課題組前期著重研究自然酸菜發酵生態系統中的菌群演替情況，并對菌體進行分離鑒定[18]。本研究以此作為基礎，以分離自自然酸菜發酵液中高產乳酸的L. casei 11MZ-5-1為發酵劑[19]，構建酸菜發酵微生物生態系統研究模型，對比分析L. casei 11MZ-5-1酸菜發酵過程中有機酸、總酸、亞硝酸鹽、VC、甘油、乙醇、甘露醇、2,3-丁二醇等關鍵代謝產物，揮發性風味物質及細菌多樣性的差異。研究結果有助于酸菜工藝的監控和質量標準的建立，對加菌酸菜質量穩定性的提高和產業發展水平的提升具有實踐指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及材料

L. casei 11MZ-5-1保藏于黑龍江大學微生物重點實驗室。

中國大白菜 哈爾濱哈達蔬菜批發市場；食用鹽中國鹽業總公司；180 L自制發酵罐由課題組自行設計研制。

1.1.2 試劑盒

M2023細菌基因組DNA提取試劑盒、L9014瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、M1603質粒小提試劑盒 天根生化科技有限公司；S004細菌微量生化鑒定管、S022嗜熱鏈球菌生化鑒定套裝、S021乳酸桿菌生化鑒定套裝、S001腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管 北京路橋技術有限責任公司。

1.2 培養基

MRS培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，K2HPO42 g，檸檬酸銨2 g，CH3COONa·3H2O 5 g，葡萄糖20 g，吐溫80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.5，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。用于LAB的分離與培養。

YPD培養基：葡萄糖20 g，酵母粉10 g，蛋白胨20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，108 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。用于酵母菌和霉菌的分離與培養。

LB培養基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，pH 7.0～7.2，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。用于Enterobacteria的分離與培養。

KAA培養基：胰蛋白胨17.0 g，牛肉膏3.0 g，酵母浸膏5.0 g，牛膽粉10.0 g，氯化鈉5.0 g，檸檬酸鈉1.0 g，七葉苷1.0 g，檸檬酸鐵銨0.5 g，疊氮化鈉0.25 g，瓊脂13.5 g，1 000 mL蒸餾水，pH 7.0～7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。用于Enterococcus的分離與培養。

VRBA培養基：乳糖10 g，酵母浸粉3 g，中性紅0.03 g，結晶紫0.002 g，蛋白胨7 g，氯化鈉5 g，膽鹽1.5 g，瓊脂20 g，1 000 mL蒸餾水，煮沸2 min。用于Escherichia coli的分離與培養。

PCA培養基：胰蛋白胨5.0 g，酵母浸粉2.5 g，葡萄糖1.0 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.8～7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。用于好氧細菌的分離與培養。

BP培養基：牛肉膏粉5 g，胰蛋白胨10 g，酵母膏粉1 g，丙酮酸鈉10 g，甘氨酸12 g，氯化鋰5 g，瓊脂15 g，pH 6.8～7.2，蒸餾水1000 mL。用于Staphyloccocus aureus的分離與培養。

BCS培養基：氯化鈉10.0 g，胰酪蛋白胨10.0 g，牛肉浸粉1.0 g，苯酚紅0.025 g，D-甘露醇10.0 g，瓊脂12.0 g，pH 6.8～7.2。用于Bacillus cereus的分離與培養。

SPS培養基：酵母浸粉10.0 g，胰酪蛋白胨15.0 g，亞硫酸鈉0.5 g，檸檬酸鐵0.5 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.8～7.2。用于Clostridium的分離與培養。

FB培養基：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸粉5.0 g，氯化鈉10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.9～7.1。用于Listeria monocytogenes的分離與培養。

PALCAM培養基：酵母浸粉3.0 g，D-葡萄糖0.5 g，氯化鋰15.0 g，蛋白胨23.0 g，可溶性淀粉1.0 g，D-甘露醇10.0 g，七葉苷0.8 g，檸檬酸鐵銨0.5 g，氯化鈉5.0 g，酚紅0.08 g，瓊脂13.0 g，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.4。用于Salmonella的分離與培養。

1.3 方法

1.3.1 酸菜發酵系統構建

自然發酵酸菜系統（以下簡稱CK）：選取優質實心白菜，晾曬2 d后去除壞葉，用自來水清洗干凈，90 kg白菜逐層放置于發酵罐中壓實，加入1.35 kg食鹽，并用70 L水浸泡白菜，于15～20 ℃密封靜置發酵。L. casei 11MZ-5-1發酵酸菜系統（以下簡稱BA）：取90 mL對數生長期的L. casei 11MZ-5-1作為發酵劑，接入到酸菜發酵生態系統。發酵時間為25 d，從第1天開始按奇數天取樣，測定各項指標，至發酵結束。

1.3.2 pH值及總酸的測定

用TOLEDO FE20型pH計測定發酵液pH值。參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[20]測定酸菜樣品中總酸的含量（以乳酸計）。

1.3.3 亞硝酸鹽及VC含量的測定

采用食品中亞硝酸鹽測試試劑盒測定酸菜發酵液中亞硝酸鹽的含量，具體實驗方法按照試劑盒說明書進行。參照李軍[21]的方法測定酸菜發酵液中VC的含量。

1.3.4 風味物質含量的測定

甘露醇含量測定參照蔣華等[22]的方法；乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、甘油、甘露醇、乙醇、2,3-丁二醇含量利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測。依照趙丹等[4]的方法，利用氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）檢測酯類、烷類、萜類、醛類、酮類、醚類、醇類、苯及衍生物類、萘及衍生物類、含硫化合物和雜環化合物揮發性風味物質的含量。1.3.5 酸菜感官評價

邀請10 名經過感官品評培訓的人員組成評定小組，依據韓德權等[23]的方法從色澤、香氣、口味、脆度及整體評價這5 項指標對酸菜進行品評。

1.3.6 BA酸菜中不同種屬細菌的分離純化與計數

在整個發酵過程中，取奇數天發酵液樣品10 mL，按10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6進行梯度稀釋，將稀釋液分別涂布于MRS、YPD、VRBA、BP、KAA、PCA等平板上，每個稀釋度平行涂布3 個平板，在各自適宜的溫度下，培養24～48 h，分別檢測LAB、酵母菌、霉菌、好氧細菌、E. coli、Enterobacteria、Enterococcus、Staphyloccocus aureus、Bacillus cereus、Clostridium、Listeria monocytogenes、Salmonella，并進行活菌計數。分析隨著發酵時間的延長，酸菜發酵系統中菌體的多樣性及演替情況。

1.3.7 BA酸菜發酵過程中菌體形態學、生理生化及16S rDNA鑒定

將培養基中分離得到的菌種，反復于新鮮的平板上進行三區劃線，直至得到單菌落。分別對這些純化的菌株進行個體顯微形態（大小、形狀、革蘭氏染色）觀察和群體形態（菌落大小、直徑、光澤、形態、邊緣、中央突起情況等）觀察。將顯微結構和菌體形態相似的菌株歸為一類。菌株生理生化實驗采用試劑盒進行鑒定，方法詳見說明書。

取3 mL菌株發酵液，離心后收集菌體，用菌體基因組DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA，根據細菌的16S rDNA基因序列的保守區域，采用細菌通用引物（P1：5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’；P2：5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’），對分離純化菌株進行16S rDNA部分序列的擴增。聚合酶鏈式反應（polymerase chain raction，PCR）條件為95 ℃、2 min；94 ℃、60 s，56 ℃、50 s，72 ℃、1 min，30 個循環。將擴增產物進行瓊脂糖凝膠DNA回收，并與質粒載體pMD18-T vector進行連接，將連接產物轉入100 μL E. coli DH5α感受態細胞，藍白篩選之后，挑取單菌落在含有氨芐青霉素（50 mg/mL）的5 mL LB液體培養基中37 ℃、170 r/min振蕩培養過夜，提取質粒（30 μL），并送交博仕生物技術有限公司進行測序。將測序得到的序列提交GenBank數據庫，應用BLAST程序與數據庫中已有的細菌16S rDNA序列進行同源性比較分析。綜合分析分離純化菌株的形態、生理生化和16S rDNA測序結果，判斷菌株的種屬分類地位。

1.4 數據統計分析

每項實驗均重復進行3 次，數據以 ±s表示。運用SPSS Statistics19軟件對數據進行統計學分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 pH值和總酸含量變化結果

圖1 酸菜發酵過程中pH值和總酸含量的變化Fig. 1 Changes in pH value and acidity during fermentation of pickled Chinese cabbage

由圖1可知，在發酵起始階段（1 d），pH 5.5～5.7，隨著發酵時間的延長，pH值呈現先急速下降后趨于穩定的趨勢，且BA中pH值下降速率快于CK。在發酵末期，BA的pH值略低于CK，分別為3.32±0.02和3.37±0.04。一般來說，酸菜發酵液的pH值達到3.5～3.8，認為酸菜已成熟，風味品質最佳，即可食用。

總酸含量隨發酵時間的延長不斷增加，且BA總酸含量增加速率快于CK。這是因為發酵初期，BA中L. casei 11MZ-5-1繁殖速率快，進行同型乳酸發酵產生大量乳酸，CK中LAB含量較少，繁殖周期較長，產酸量低于BA。同時，有機酸的大量積累，能夠抑制LAB菌群生長，而L. casei 11MZ-5-1耐酸性較強，導致BA總酸含量持續增加。在發酵末期，總酸質量濃度分別為（7.59±0.11）g/L（CK）和（7.88±0.09）g/L（BA）。

2.2 亞硝酸鹽含量和VC含量的變化

如圖2所示，CK中亞硝酸鹽的含量呈先升高后降低的趨勢，在發酵第7天時出現一個明顯的亞硝酸鹽峰，峰值為（18.35±0.27）mg/kg，直至第17天幾乎消失。因為發酵初期，LAB含量較少，雜菌含量較多，尤其是含硝酸鹽還原酶的雜菌能夠將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，導致形成亞硝酸鹽峰[24]。而BA中始終沒有出現亞硝酸鹽峰，含量維持在1.00 mg/kg以下，在發酵末期為（0.27±0.04）mg/kg，遠低于國家衛生標準（20.00 mg/kg）。這是因為發酵初期L. casei 11MZ-5-1產生大量乳酸，有效抑制其他雜菌的活動。

圖2 酸菜發酵過程中亞硝酸鹽含量和VC含量的變化Fig. 2 Changes in nitrite and VC content during fermentation of pickled Chinese cabbage

VC的含量隨著發酵時間的延長，呈現明顯的下降趨勢，在發酵末期趨于穩定，且CK中VC含量下降速率快于BA。這是由于VC是己糖衍生物，易溶于水，在酸性環境中穩定[17]。L. casei 11MZ-5-1在BA中大量繁殖，迅速產酸，減慢VC的降解速率，在發酵15 d穩定在438～445 mg/kg。CK中，發酵初期總酸含量較低，微生物種類比較復雜，更多地利用VC，使得VC含量下降較快，最終為（287.76±5.81）mg/kg，少于BA。因此可以看出，L. casei 11MZ-5-1作為發酵劑，不僅可以迅速降低發酵系統的pH值，還可以防止VC的降解，顯著改善酸菜的品質。

2.3 風味物質的含量變化

由表1可知，乳酸在2 個發酵系統中都隨著發酵時間的延長，呈現先急速上升后緩慢上升最后趨于平穩的趨勢，在發酵末期質量濃度達到最高，分別為（7.02±0.11）g/L（CK）和（8.98±0.46）g/L（BA）。乳酸是代表酸菜營養程度的指標，一般在乳酸含量不明顯增加的時間結束發酵，獲取酸菜產品[25]。本研究發現BA中乳酸的含量始終高于CK并先于CK達到最高值趨于穩定。此趨勢與崔松林等[26]研究酸菜發酵過程中乳酸變化情況相同。乙酸在兩種發酵系統中的變化趨勢與乳酸相一致，在發酵末期，質量濃度分別為（0.53±0.02）g/L（CK）和（0.50±0.03）g/L（BA）。檸檬酸、琥珀酸和蘋果酸含量呈現先上升后下降最終趨于穩定的趨勢。檸檬酸可以為酸菜提供溫和爽快、有新鮮感的感官品質，也是酸菜發酵過程中風味形成的重要參考指標。發酵末期，BA中有機酸的含量高于CK。出現這種情況可能是因為CK中的細菌種類較多，影響或阻止了發酵過程的正向發展，而BA中由于外源的接入L. casei 11MZ-5-1，導致發酵環境相對較早的形成，菌體通過代謝產生大量的有機酸，迅速降低發酵系統的pH值，縮短發酵周期。

隨著發酵時間的延長，甘油含量呈現先升高后下降的趨勢，且BA高于CK，在發酵末期分別為（0.36±0.02）g/L和（0.31±0.03）g/L（P＜0.05）。甘露醇含量也呈現先升高后降低的趨勢，BA峰值出現早，在發酵末期，質量濃度分別為（12.28±0.30）g/L（CK）和（13.82±0.42）g/L（BA）。乙醇含量變化趨勢同乳酸，隨著發酵時間的延長，含量不斷上升，在發酵末期保持穩定，兩體系相差較小。2,3-丁二醇含量變化與甘油含量的變化趨勢一致，呈現先升高后降低的趨勢，且BA始終高于CK，在發酵末期分別為（0.13±0.02）g/L（CK）和（0.22±0.02）g/L（BA）（P＜0.05）。由上可知，在酸菜發酵末期，甘油、甘露醇、2,3-丁二醇在BA內的含量高于CK。因此，L. casei 11MZ-5-1能夠顯著地改善酸菜的品質，為酸菜帶來更豐富的風味、口味。

表1 酸菜發酵過程中9 種代謝產物的含量Table 1 Contents of 9 metabolites during fermentation of pickled Chinese cabbage

如圖3所示，BA中揮發性化合物的總相對含量為（91.13±4.29）%，顯著高于CK（（78.44±2.61）%）（P＜0.05）。在BA樣品中，除烷類的含量顯著低于CK（（19.31±1.87）%）（P＜0.05），酯類、萜類、醛類、酮類、醚類、醇類、苯及衍生物類、萘及衍生物類、含硫化合物和雜環化合物的含量均高于CK。大量研究發現，烷類對酸菜風味的貢獻較小[27]；醛類可以賦予酸菜清香、堅果香和果香[28]；酮類賦予酸菜奶油的香味；醇類賦予酸菜水果香、甜香以及酒香味[29]。L. casei 11MZ-5-1發酵酸菜中各揮發性化合物均處于較高水平，因此風味濃郁。

圖3 酸菜樣品揮發性化合物相對含量Fig. 3 Relative contents of flavor compounds in pickled Chinese cabbage

2.4 酸菜感官評價結果

對比2 種酸菜樣品，BA樣品整體感官評分為（2.33±0.12）分，高于CK樣品（（1.87±0.06）分）。從色澤、香氣、口味、脆度等指標進行評價，BA的分數均高于CK（P＜0.05）。由此看出，L. casei 11MZ-5-1作為發酵劑可顯著改善酸菜的感官品質。

2.5 L. casei 11MZ-5-1酸菜發酵過程中菌體的多樣性及演替分析

圖4 L. casei11MZ-5-1酸菜發酵過程中菌體數量變化Fig. 4 Change in bacterial number during L. casei 11MZ-5-1 fermentation of pickled Chinese cabbage

利用不同種類選擇培養基，分離酸菜發酵過程中的菌體，結果如圖4所示。在整個發酵過程中共分離得到6 類菌體，分別為LAB、好氧菌、Saccharomyces、Enterobacter、Enterococcus和E. coli，并未分離得到S. aureus、B. cereus、Clostridium difficile、L. monocytogenes和Salmonella。LAB作為優勢菌在數量上呈現先增加后保持不變的趨勢，好氧菌則呈平穩生長趨勢；Saccharomycetes、Enterobacter、Enterococcus和E. coli的菌體數量則呈現不斷降低的趨勢。在發酵末期，未檢測到Enterobacter、Enterococcus和E. coli。因此，可以看出，隨著發酵時間的延長，LAB逐漸成為發酵系統的優勢菌，主導整個發酵過程，而Enterobacter等菌體因為耐酸能力較低，不能在較酸的環境下生存，因此隨著LAB數量的增加逐漸減少。

2.6 L. casei 11MZ-5-1酸菜發酵過程中菌體種類鑒定結果

本研究從L. casei 11MZ-5-1酸菜發酵液中共分離得到14 株細菌，少于自然酸菜發酵液（18 株）[18]，分別編號1～14。14 株細菌的顯微形態及菌落形態統計如表2所示。其中MRS培養基中共分離出5 株LAB，多于其他種類菌體，菌體直徑均小于1 mm，呈乳白色、桿狀，革蘭氏陽性（G+）；PCA培養基中分離出的菌體，菌落大小不一，表面光滑，菌體形態為球狀。從BP、YPD、VRBA和KAA培養基中分別分離出2、2、1 種和2 種菌體，其中9號菌為紅色，顯著有別于其他菌體。

表2 L. casei 11MZ-5-1酸菜發酵系統中菌株菌落形態及顯微形態特征Table 2 Colony and microscopic morphology of bacteria isolated from L.casei 11MZ-5-1 fermented Chinese cabbage samples

經生理生化鑒定及16S rDNA鑒定（表3），結果顯示1號為L. casei，NCBI序列比對結果與菌株NC014334.1具有較高的相似度，且結果與先前的研究一致[19]；3、4號為L. brevis，且NCBI序列比對結果與菌株AP012167.1具有較高的相似度，因此將這2 株菌統一分類為同一株L. brevis；7和13號為未培養細菌；2號為Lactobacillus；5號為L. plantarum；6號為Acinetobacter sp.，8號為Enterobacter sp.，9號為Klebsiella pneumoniae，10號為C. albicaus；11號為Saccharomyces，12號為E. coli，14號為Staphylococcus sp.。賀稚非等[30]通過對酸菜發酵過程中微生物群落進行分析得出，在酸菜發酵過程中，原料表面上的微生物生長繁殖，主要有Saccharomyces、Lactococcus、Pseudomonas、Enterobacter等；同時，LAB也有所增加，主要為Lactococcus、Leuconostoc和Pediococcus等，但產酸量低；當發酵進入中期時，Lactobacillus大量繁殖，產生較強的酸性、缺氧環境，使得不耐酸的Enterobacter等細菌以及霉菌受到抑制；隨著發酵的不斷進行，發酵液中的微生物主要是Lactobacillus、Lactococcus和Saccharomyces。本研究BA中菌群的演替情況與前者的研究較為相似。因此可以看出L. casei 11MZ-5-1作為發酵劑，不僅可以防止腐敗菌的生成，減少發酵系統中菌群的種類及數量，還可以縮短發酵周期，使發酵系統向正向快速發展。

表3 L. casei11MZ-5-1酸菜發酵過程中分離菌株16S rDNA BLAST比對結果Table 3 16S rDNA sequence analysis by BLAST of strains isolated from L.casei11MZ-5-1 fermented Chinese cabbage pickle

3 結 論

本研究以分離自酸菜發酵液的L. casei 11MZ-5-1為發酵劑，對比分析L. casei 11MZ-5-1發酵酸菜和自然發酵酸菜樣品重要代謝物、揮發性風味物質的含量及菌群分布情況。總酸含量與VC含量呈正相關，與亞硝酸鹽含量呈負相關。其中L. casei 11MZ-5-1發酵酸菜中，總酸含量較高，VC含量最大，亞硝酸鹽含量最低，甘油、甘露醇、2,3-丁二醇等有益代謝產物及揮發性風味物質的含量高于自然酸菜發酵微生物生態系統。此外，隨著發酵的進行，兩體系中細菌大量繁殖。自然酸菜發酵微生物生態系統微生物種類高于L. casei 11MZ-5-1發酵酸菜微生物生態系統，且在整個發酵過程中，L. casei始終保持優勢地位。由此可以看出，L. casei 11MZ-5-1作為酸菜發酵劑，可以增加酸菜的總酸含量，降低亞硝酸鹽含量，防止VC降解，加強風味物質含量，防止腐敗菌的生長，從而提高酸菜安全性和營養價值。