1 株類胡蘿卜素產生菌的鑒定及其發酵培養基的優化

孔維寶，楊 洋，陳 冬，汪 洋，達文燕，牛世全

（西北師范大學生命科學學院，甘肅 蘭州 730070）

類胡蘿卜素是一類含有40 個碳的類異戊烯四萜化合物及其衍生物的總稱，外觀呈黃色、橙紅色或紅色，分為胡蘿卜素和葉黃素兩大類。自然界中，類胡蘿卜素主要由一些高等植物和微生物合成；人體因自身不能合成類胡蘿卜素，主要從日常膳食中攝取。類胡蘿卜素不僅是人類膳食營養中重要的組成部分，具有VA的活性，而且還具有抗氧化、預防夜盲癥、抗癌等藥理作用，在醫藥和保健食品領域具有廣泛用途[1-2]。

目前，生產類胡蘿卜素的方法主要有植物提取法、化學合成法和微生物發酵法。其中微生物發酵法具有生產原料不受限制、易于工業化生產、生產周期短、生產效率高、天然安全、色澤豐富等優勢，逐漸成為類胡蘿卜素生產的主要方法[3]。合成類胡蘿卜素的主要微生物種類有光合細菌、杜氏藻、雨生紅球藻、三孢布拉霉、卷枝毛霉、紅酵母等[4-6]。Buzzini等[7]研究了Rhodotorula、Rhodosporidium、Sporobolomyces和Sporidiobolus 4 個屬的13 個菌株積累色素的情況，將培養5 d的菌體收集，測得總色素含量（以干菌體計）為16.40～184.00 μg/g，經色譜鑒定主要組分為紅酵母紅素、紅酵母烯、γ-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素。樊竹青等[8]對分離自云南撫仙湖水的379 株酵母菌進行產類胡蘿卜素的篩選研究結果顯示，83.91%的供試菌具有產類胡蘿卜素的能力，大部分菌株產量在10～300 μg/g之間，最高達590.83 μg/g；產類胡蘿卜素酵母集中分布于紅冬孢酵母屬（Rhodosporidium）和紅酵母屬（Rhodotorula），擔子菌酵母產類胡蘿卜素的能力高于子囊菌酵母。Chagas等[9]設計了微藻光生物反應器與酵母發酵集成培養裝置，研究利用啤酒發酵時產生的CO2培養杜氏鹽藻用于類胡蘿卜素的生產，結果顯示類胡蘿卜素的產量（以干菌體計）可達4.74 g/g，產率可達0.86 mg/（L·d）。以Rhodotorula glutinis YB-252為菌種采用固態發酵方法生產類胡蘿卜素時，在優化條件下可獲得340 mg/L的番茄紅素[10]。

但是，目前用于工業化生產類胡蘿卜素的微生物菌種還十分有限，從自然界中篩選高產類胡蘿卜素的優良菌種仍具有較高的研究和開發價值。本實驗結合傳統和現代微生物分類學方法，對1 株從土壤中分離獲得的具有類胡蘿卜素生產潛力的菌株進行鑒定，測定其生長特性和類胡蘿卜素的穩定性，并優化其發酵培養基組成，旨在為采用發酵法生產類胡蘿卜素提供菌種資源和工藝參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

產色素菌株K-1由本實驗室從土壤中分離純化并保藏。

1.1.2 試劑

牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、瓊脂等試劑購自青島海博生物技術有限公司，其他化學試劑均為分析純；12.5%豆芽汁、牛板油等為自制。

1.1.3 培養基

麥芽汁瓊脂培養基、明膠培養基、牛奶胨化培養基、產脂培養基等生理生化鑒定培養基的配制方法參考文獻[11-12]；YEPD培養基：酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，115 ℃滅菌15 min，固體培養基加2%瓊脂粉，pH 6.0；基礎培養基：葡萄糖30 g/L、蛋白胨5 g/L、KH2PO41 g/L、無水MgSO40.5 g/L、CaCl20.1 g/L、NaCl 0.1 g/L、pH 5.5；培養基121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

CP114電子分析天平 美國奧豪斯公司；GI54T立式高壓蒸汽滅菌鍋 美國致微公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；UV-2800紫外-可見分光光度計 上海優尼柯公司；ZWYR-211D大容量恒溫振蕩搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；DHG型電熱恒溫干燥箱 上海瑯玕實驗設備有限公司；研究級倒置熒光顯微鏡 德國Leika公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的鑒定

1.3.1.1 菌株K-1的形態學及生理生化鑒定

參照文獻[13]進行實驗。

1.3.1.2 菌株K-1的分子生物學鑒定方法

參照文獻[14]方法對菌株的DNA基因組進行提取，使用真菌核糖體ITS基因片段的通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR總體系為20 μL：2×Taq PCR StarMix 10 μL，上下游引物各取1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O補至20 μL。PCR程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共35 個循環；最后72 ℃延伸10 min。將擴增后的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收后進行測序。測序后將結果輸入NCBI的GenBank數據庫中，利用BLAST程序進行同源序列比較分析，采用MEGA 5.0軟件中的Neighbor-Joining方法構建所測菌株的系統發育樹，自展值為1 000 次。

1.3.2 類胡蘿卜素的提取、定性及胞外穩定性測定

類胡蘿卜素提取：菌體破壁處理采用改良過的酸熱法[15-16]，用丙酮作提取劑[17]。準確稱量0.1 g凍干的菌體干粉，加入6 mL 3 mol/L HCl溶液，置于渦旋混合器上充分混勻10 min，沸水浴處理6 min，置于冰浴中速冷6 min，4 000 r/min離心15 min，棄去上清液后用蒸餾水洗滌菌體2 次，4 000 r/min離心15 min后去除上清液。向已破壁處理的菌體中加入6 mL丙酮，置于渦旋器上充分混合3 min，重復提取至菌體變白且無明顯顏色變化，合并提取液，用丙酮定容后測定。

類胡蘿卜素的定性：在取少量上述實驗得到的丙酮浸提液置于平面皿中，放置數分鐘適當滴加1滴濃硫酸，以丙酮作為空白對照，若變藍色或藍綠色，則可證明丙酮浸提液中含有類胡蘿卜素。采用分光光度法將色素丙酮浸提液在380～800 nm波長下進行全波長掃描，確定最大吸收波長，并對該菌色素特征吸收峰進行光譜分析[18-19]。

類胡蘿卜素提取液的穩定性測定：將類胡蘿卜素的丙酮提取液置于系列溫度梯度環境中30 min后，測定吸光度A486nm變化，考察溫度對其穩定性的影響；將提取液置于0、2 600、6 400 lx光照強度下24 h后，測定其吸光度A486nm，考察光強度對其穩定性的影響；向類胡蘿卜素丙酮提取液中分別加入0.1 mL 3% H2O2溶液、0.01%二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）溶液，以丙酮浸提液為空白對照，置于室溫下避光放置24 h后測定A486nm變化，考察氧化劑和抗氧化劑對其穩定性的影響。結果以吸光度下降率表示，按式（1）計算：

式中：Ai為起始A486nm；Ae為放置24 h后的A486nm。

1.3.3 培養基優化

1.3.3.1 種子液的制備及發酵條件

將菌種從斜面活化培養基中接入裝有50 mL液體YEPD種子培養基的250 mL三角瓶中，28 ℃、150 r/min培養24 h后，再將其以10%的接種量接入裝有50 mL液體YEPD培養基的三角瓶中，28 ℃、150 r/min培養12 h，將該培養液作為種子液用于接種發酵。

液態發酵條件均為裝液量50 mL/250 mL三角瓶、接種量10%，搖床轉速150 r/min，溫度 （30±2）℃，培養基初始pH 5.5，培養5 d后，分離提取，測定菌體質量濃度和類胡蘿卜素產量。

1.3.3.2 單因素試驗

在基礎培養基的基礎上，分別考察葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘油等碳源種類（添加量均為30 g/L）及葡萄糖質量濃度（20、30、40、50、60 g/L），酵母粉、蛋白胨、(NH4)2SO4等氮源種類（添加量均為5 g/L）及(NH4)2SO4質量濃度（5、10、15、20、25、30、40、50 g/L），K2HPO4·3H2O質量濃度（0、0.25、0.50、0.75、1.0、1.25 g/L），無水CaCl2質量濃度（0、1、2、3、4、5 g/L），檸檬酸三鈉質量濃度（0、2.5、5.0、7.5、10、12.5 g/L）對菌株K-1生長及類胡蘿卜素合成的影響，根據類胡蘿卜素產量篩選影響顯著的因素和水平，以便進一步采用正交試驗優化培養基組成。

1.3.3.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，根據不同營養物質質量濃度對菌株K-1菌體和類胡蘿卜素產量的綜合影響，篩選影響較為顯著的葡萄糖、(NH4)2SO4、無水CaCl2、檸檬酸三鈉4 個影響因素，采用4因素3水平正交試驗（表1）設計方案進一步優化培養基組成。

表1 L9（34）正交試驗設計Table 1 Code and level of independent variables used for L9 (34) orthogonal array design g/L

1.3.4 指標的測定

1.3.4.1 菌體質量濃度的測定

吸取4 mL發酵液加入已烘干稱質量的5 mL離心管中，5 000 r/min離心10 min，棄去上清液后菌體沉淀物用蒸餾水洗滌，同樣條件下離心后棄去上清液，含菌體的離心管在105 ℃烘干至恒質量，置于干燥器中冷卻至室溫后稱質量，按式（2）計算菌體質量濃度：

式中：M1為帶菌體管干質量/g；M為空管干質量/g；V為發酵液體積/mL。

1.3.4.2 類胡蘿卜素產量的測定

向破壁菌體中加入6 mL丙酮后充分混合，重復提取至菌體變白，合并提取液，用丙酮定容后待測。提取液適當稀釋后用比色法測定類胡蘿卜素產量，測定波長為486 nm，根據文獻[6,16-19]方法計算類胡蘿卜素產量，計算見公式（3）：

式中：A為類胡蘿卜素最大吸收波長下的吸光度；D為樣品稀釋倍數；V為提取所用溶劑體積/mL；m為菌體干質量/g；0.16為類胡蘿卜素消光系數/（L/mg）。

1.4 數據統計與分析

數據統計采用Excel 2010軟件，顯著性分析采用SPSS 19.0軟件，正交試驗設計采用正交設計助手II 3.1軟件。數據以 ±s表示（n=3），P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 菌株K-1的鑒定結果

2.1.1 形態學鑒定

在培養基中點植接種，15 d后能夠形成直徑約為（1.9±0.1）cm的菌落（圖1A），菌落顏色由白色逐漸變為橙紅色，表面光亮，有時呈現網狀或縮成波狀，質地軟而呈黏狀。培養基顏色未有明顯變化，無滲出物形成，氣味為特殊臭味。通過玉米粉瓊脂培養基進行蓋片培養，未觀察到假菌絲。

圖1 菌株K-1的形態特征Fig. 1 Morphological characteristics of strain K-1

在麥芽汁培養基中30 ℃培養3～5 d，細胞為短卵形，單個或者成對，細胞大小為3～6 μm，能形成完整環和沉淀，培養1 個月以上，菌體呈現深粉紅色，可形成醭，菌體呈黏液狀，為出芽生殖（圖1B），不能形成子囊孢子和擲孢子。

2.1.2 生理生化鑒定

表2 菌株K-1的碳源同化測試結果Table 2 Carbon source assimilation pattern of strain K-1

由表2可知，碳源同化實驗結果顯示，該菌株能利用葡萄糖、果糖等12 種糖，不能利用乳糖和可溶性淀粉，能利用甘油、甘露醇、檸檬酸、蘋果酸、氨基乙酸，不能利用對氨基苯甲酸、乙醇、肌醇、山梨醇和山梨酸；氮源同化實驗結果顯示，該菌不能利用尿素，能利用硫酸銨、蛋白胨和酵母膏，能利用VB1和VB6；生理生化檢測結果顯示，該菌不能在無維生素的環境中生長，不能利用硝酸鉀，5 g/L的亞硝酸鈉對菌體有強的致死作用，可使牛奶發生胨化，不產芳香物質，不能使明膠液化，可在50%高滲培養基上生長。

2.1.3 分子生物學鑒定

由圖2可知，目的基因PCR產物約為620 bp。將菌株K-1 ITS序列通過BLAST程序與GenBank數據庫中現已報道的ITS基因序列進行相似性比對分析，構建的系統進化樹如圖3所示。結果顯示，菌株K1與膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）的相似性為99%，并結合菌株形態學、生理生化特性初步鑒定為膠紅酵母。

圖2 菌株K-1 PCR產物電泳圖譜Fig. 2 Electrophoresis pattern of PCR products of genomic DNA from strain K-1

圖3 基于菌株K-1的ITS序列構建的系統發育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strain K-1 based on ITS sequences

2.2 菌株K-1產類胡蘿卜素的定性及穩定性結果

2.2.1 色素定性

圖4 膠紅酵母K-1丙酮提取物的可見光波長掃描Fig. 4 Visible absorption spectrum of the acetone extract from R. mucilaginosa K-1

將菌體丙酮提取液在380～800 nm波長下進行掃描。由圖4可知，菌株K-1的丙酮提取液在486 nm波長處存在最大吸收峰，將此結果與Perrier等[20]在486 nm波長下不同類胡蘿卜素特征吸收峰進行比對，初步確定該菌體K-1色素含有多種類胡蘿卜素混合物。將此結果與Fraser等[21]的研究中膠紅酵母CBS316主要的3 種類胡蘿卜素的吸收光譜相比較，在484 nm波長處有最大吸收峰的色素為紅酵母烯。其中對類胡蘿卜素測定方法的描述中，確定其比色法檢測時的波長為486 nm，該結果與菌株K-1的丙酮浸提液存在最大吸收峰的結果一致。

2.2.2 色素胞外穩定性結果

圖5 膠紅酵母K-1的色素穩定性測試結果Fig. 5 Stability of the pigments from R. mucilaginosa K-1

將K-1菌體類胡蘿卜素丙酮浸提液稀釋至486 nm波長處的吸光度為0.426，分別放置在不同的溫度、光照、氧化劑和還原劑的條件下測定計算A486nm下降率，考察其胞外穩定性，結果如圖5所示。在20～100 ℃溫度范圍內將色素提取物處理30 min后，其A486nm隨處理溫度的升高而不斷增大，在60、100 ℃下處理30 min后A486nm的下降率分別為13.62%和22.85%，說明低溫處理有利于保護其穩定性，而高溫具有破壞作用，由此也反映出該色素提取物具有較好的熱穩定性。色素提取物在室溫下放置24 h，光照強度為6 400 lx處理組的A486nm下降率最快，為56.42%，而2 600 lx光照強度處理組的下降率為34.19%，而0 lx對照組的下降率為12.75%，這一結果說明光照強度對K-1菌株產類胡蘿卜素的胞外穩定性有顯著影響，因此在保存時要盡量采取避光措施。

類胡蘿卜素是一種抗氧化劑，其在生物體內能起到良好的抗氧化作用[22]。H2O2和BHT分別是常用的氧化劑和抗氧化劑，所以用這2 種物質對受試類胡蘿卜素的胞外穩定性進行評價。與對照組相比，加入氧化劑H2O2的受試組吸光度下降率高于對照組，而添加BHT組吸光度較對照組低，這說明H2O2處理對K-1菌體所產類胡蘿卜素的胞外穩定性影響較小，BHT能夠保護和維持菌體類胡蘿卜素的胞外穩定性。本實驗有關膠紅酵母色素耐熱性、光照穩定性，以及氧化劑穩定性的研究結果總體趨勢與韓永斌等[23]有關光合細菌類胡蘿卜素穩定性研究的結果相似。

2.3 碳源和氮源種類及質量濃度對K-1菌株產類胡蘿卜素的影響

2.3.1 碳源種類的影響

碳源對微生物中含碳物質的合成至關重要，尤其在探討影響類胡蘿卜素合成的因素過程中，對碳源的研究最多[24]。酵母菌代謝行為也會因碳源的種類不同而改變。將基礎培養基中的碳源設置為葡萄糖、蔗糖、甘油、麥芽糖4 種碳源進行碳源篩選實驗。從表3得出，以葡萄糖為碳源時，菌體質量濃度（以干質量計，下同）、類胡蘿卜素產量均較其他受試碳源高。蔗糖在菌體質量濃度和類胡蘿卜素產量上略低于葡萄糖。麥芽糖和甘油的影響相當，菌體質量濃度和類胡蘿卜素產量相對較低。因此，在后續實驗中選用葡萄糖作為碳源。

表3 碳源對膠紅酵母K-1類胡蘿卜素產量的影響Table 3 Effect of carbon sources on carotenoid yield of R. mucilaginosaK-1

2.3.2 葡萄糖質量濃度的影響

由表4可以得出，葡萄糖質量濃度30 g/L時類胡蘿卜素產量最高，達到（155.36±4.91）μg/g；葡萄糖質量濃度60 g/L下菌體質量濃度最高；葡萄糖質量濃度在高于30 g/L時，隨著質量濃度的增加類胡蘿卜素產量呈現下降的趨勢。這可能與菌體生長量的上升有關。由計算葡萄糖不同質量濃度培養基中的碳氮比發現，碳氮比在11～33范圍內，類胡蘿卜素產量之間無顯著性差異，但隨著碳氮比的提高，類胡蘿卜素產量呈下降趨勢。Aksu等[25]研究發現，在以葡萄糖、糖蜜蔗糖、乳清乳糖為碳源，以膠紅酵母為菌種發酵產類胡蘿卜素時，總體上隨著糖濃度的增加，酵母的生長和類胡蘿卜素產量也隨之提高，當蔗糖質量濃度為20 g/L時，發酵液中類胡蘿卜素的最高產量可達89.0 mg/L。因此，從促進菌體生長和積累合成類胡蘿卜素，以及節約成本的角度考慮，應控制好培養基中葡萄糖的質量濃度。

2.3.3 氮源種類的影響

已有研究表明，氮源種類和濃度對紅酵母產類胡蘿卜素同樣具有重要的影響[26-27]。從表5可以看出，在3 種氮源中，以酵母粉為氮源時，菌體質量濃度最高，類胡蘿卜素產量較大；(NH4)2SO4組菌體生長量最小，但其類胡蘿卜素產量最高，達到（147.16±2.27）μg/g。從類胡蘿卜素的產量和生產成本綜合考慮，(NH4)2SO4可作為該菌株發酵培養基的適宜氮源。

表5 氮源對膠紅酵母K-1類胡蘿卜素產量的影響Table 5 Effect of nitrogen sources on carotenoid yield of R. mucilaginosaK-1

2.3.4 (NH4)2SO4質量濃度的影響

表6 (NH4)2SO4對膠紅酵母K-1類胡蘿卜素產量的影響Table 6 Effect of (NH4)2SO4 concentration on carotenoids yield of R. mucilaginosaK-1

從表6可以看出，隨著(NH4)2SO4質量濃度的增加，菌體質量濃度也呈現增長趨勢。40～50 g/L時菌體質量濃度最大；質量濃度25 g/L時菌體類胡蘿卜素產量最大，達到（167.62±2.84）μg/g。

2.4 無機鹽種類和質量濃度對K-1菌株產類胡蘿卜素的影響

2.4.1 K2HPO4·3H2O質量濃度的影響

K2HPO4·3H2O為菌體的生長提供鉀源和磷源，鉀元素和磷元素是菌體生長必需的元素，K2HPO4·3H2O也能為穩定培養基的pH值起到微緩沖作用。唐棠等[28]在優化紅酵母Y-5產類胡蘿卜素培養基無機鹽組分的研究時，從8 種無機鹽中篩選出對提高類胡蘿卜素產量具有顯著效應的無機鹽組分為KH2PO4、MgSO4和NaCl。由表7可以得出，在0.25～1.25 g/L的范圍內，K2HPO4·3H2O對提高膠紅酵母菌體質量濃度有著顯著作用，當K2HPO4·3H2O質量濃度為0.25 g/L時，類胡蘿卜素產量達到最大值（161.89±3.86）μg/g，且隨著質量濃度的增加而降低。徐軍等[27]在研究無機鹽和碳氮源對青霉PT95類胡蘿卜素產率的影響時也發現，供試的4 種無機鹽中，K2HPO4的單因子效應最好，K2HPO4＋KCl＋MgSO4表現出最好的正協同效應。綜上分析說明，磷源對于菌體產類胡蘿卜素具有重要的影響。

表7 K2HPO4·3H2O對膠紅酵母K-1類胡蘿卜素產量的影響Table 7 Effect of K2HPO4·3H2O concentration on carotenoids yield of R.mucilaginosaK-1

2.4.2 無水CaCl2質量濃度的影響

表8 無水CaCl2對膠紅酵母K-1類胡蘿卜素產量的影響Table 8 Effect of CaCl2 concentration on carotenoids yield of R. mucilaginosaK-1

CaCl2主要為菌體提供Ca2＋。Ca2＋是維持菌體滲透壓的重要離子，還是某些酶的輔因子，并能維持一些微生物蛋白酶的穩定性。由表8可知，當培養基中無水CaCl2質量濃度為3 g/L時，類胡蘿卜素產量達到最大值（139.95±0.46）μg/g，在質量濃度2 g/L時，其菌體質量濃度達11.22 g/L。唐剛等[29]在研究間型脈孢菌產類胡蘿卜素時發現，當培養基中添加了1.5 mg/L沒食子酸和0.05 g/L植酸鈣后，所培養菌絲中類胡蘿卜素含量分別可達46.44 μg/g和54.03 μg/g，比對照分別提高了100%和133%。呂和鑫等[30]的研究也表明鈣離子補料能提高杜氏鹽藻細胞中類胡蘿卜素產量。上述研究結果表明培養基中添加一定濃度的鈣鹽有利于菌體合成和積累類胡蘿卜素。

2.4.3 檸檬酸三鈉質量濃度的影響

檸檬酸既可作為部分微生物的碳源，也可以作為很好的細胞生長及代謝產物調節因子。廖春麗等[31]用三孢布拉霉（Blakeslea trispora）液體發酵產β-胡蘿卜素時發現，檸檬酸濃度對產物β-胡蘿卜素的產量影響顯著。由表9可以看出，檸檬酸三鈉質量濃度為2.5 g/L時，菌體質量濃度達到最大值，檸檬酸三鈉質量濃度為7.5 g/L時，菌體類胡蘿卜素產量最高可達（167.40±4.12）μg/g，但與5 g/L和10 g/L相比沒有顯著差異。本研究結果也顯示檸檬酸鹽對膠紅酵母產類胡蘿卜素具有促進作用。

表9 檸檬酸三鈉對膠紅酵母K-1類胡蘿卜素產量的影響Table 9 Effect of trisodium citrate concentration on carotenoids yield of R. mucilaginosaK-1

2.5 正交試驗優化菌株K-1產類胡蘿卜素結果

表10 L9（34）正交試驗結果Table 10 Experimental design and results of L9 (34) orthogonal array

從提高類胡蘿卜素的發酵產量考慮，一方面應保證較高的菌體濃度，另一方面應盡量提高菌體中目標產物的量。根據單因素試驗結果分析可知，碳源和氮源對菌體質量濃度的影響較為顯著，而無水CaCl2和檸檬酸三鈉對菌體細胞中類胡蘿卜素產量的積累影響較為顯著。因此，選擇葡萄糖、(NH4)2SO4、無水CaCl2和檸檬酸三鈉4 個對菌體質量濃度和色素產量影響較為顯著的營養物質，設計4因素3水平正交試驗，進一步優化發酵培養基組成。其他發酵條件同單因素試驗條件，正交試驗設計及結果如表10所示。

表11 正交試驗結果方差分析Table 11 Analysis of variance of the results from orthogonal array design

由表10可知，影響類胡蘿卜素產量的因素主次順序為：葡萄糖質量濃度＞無水CaCl2質量濃度＞檸檬酸三鈉質量濃度＞(NH4)2SO4質量濃度；最優水平最佳組合為A1B1C1D1，即葡萄糖20 g/L，(NH4)2SO420g/L，無水CaCl22 g/L，檸檬酸三鈉 5 g/L。在此基礎上，對正交試驗結果進行方差分析，見表11。結果表明：葡萄糖對類胡蘿卜素產量的影響顯著（P＜0.05）；而(NH4)2SO4、無水CaCl2和檸檬酸三鈉對類胡蘿卜素產量影響不顯著（P＞0.05）。對最優水平進行驗證實驗，類胡蘿卜素產量為（180.14±2.45）μg/g。發酵培養基經優化后，類胡蘿卜素產量比未優化前提高了43.13%。

3 結 論

在玉米粉瓊脂、麥芽汁等培養基上對菌株K-1進行形態學鑒定；生理生化檢測結果顯示，該菌株能利用葡萄糖、果糖等12 種糖以及甘油、甘露醇、檸檬酸、蘋果酸、氨基乙酸等物質可作為碳源，還能以(NH4)2SO4、蛋白胨和酵母膏等作為氮源，但不能利用KNO3，不產芳香物質，不能在無維生素的環境中生長，5 g/L的NaNO2對菌體有致死作用；將菌株K-1測序所得的ITS序列在NCBI數據庫中進行比對，最終鑒定該菌株為R. mucilaginosa，即膠紅酵母。

對菌體的丙酮提取液進行波長掃描，在486 nm波長處存在最大吸收峰，與已報道的紅酵母烯的最大吸收峰相近，表明提取物中的主要成分可能為紅酵母烯。

將膠紅酵母K-1丙酮浸提液在不同溫度、光照、氧化劑和還原劑條件下處理，考察其胞外穩定性，結果顯示低溫、避光處理有利于維持其穩定性，高溫、強光照對其穩定性有破壞作用，H2O2處理對其胞外穩定性影響較小，BHT能夠保護和維持其胞外穩定性。

選取碳源、氮源、無機鹽種類及其質量濃度作為試驗因素，類胡蘿卜素產量作為衡量指標，結合單因素和正交試驗優化了菌株K-1產類胡蘿卜素的培養基組成，最終確定其優化的培養基組成為20 g/L葡萄糖、20 g/L(NH4)2SO4、2 g/L無水CaCl2、5 g/L檸檬酸三鈉（培養溫度30 ℃、接種量10%、搖床轉速150 r/min、裝瓶量50 mL/250 mL、初始pH 5.5、培養5 d），該優化條件下類胡蘿卜素產量（干質量計）可達（180.14±2.45）μg/g，比未優化前的提高了43.13%。

研究表明，膠紅酵母K-1生長性能良好、色素穩定性高，具有發酵高產類胡蘿卜素的潛能。參考文獻：

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