高光譜技術融合平板菌落法同步計數酸奶中益生菌

石吉勇，吳勝斌，鄒小波*，張 芳，趙 號，李文亭

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013）

益生菌是指宿主攝入一定量后對宿主產生保健作用的一類活性有益微生物[1-2]。研究表明，酸奶中的益生菌進入腸道后，具有改善腸道正常菌群、抗癌抗腫瘤、增強人體自身免疫力等重要功效[3-5]。目前市面上常見的功能性酸奶中含有的菌種主要有保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和植物乳桿菌等。其中，干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌為常見的益生菌種，而保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌在酸奶中主要起發酵作用[6-7]，屬于發酵菌種，難以通過胃部進入腸道正常的生長繁殖，不能發揮其保健功能。因此開發一種酸奶中益生菌的簡單、快速、高效的鑒別計數方法對于維護消費者權益和保障食品安全具有重要意義。

傳統鑒別計數食品中微生物的方法主要有形態學鑒別計數法[8-9]、分子生物學定量法[10-12]、機器視覺法[13-16]等。形態學鑒別計數法主要是通過染色、鏡檢等方法獲取特定微生物的培養形態及特征進行檢測，具有直觀、準確等優點，但該方法費時費力、操作繁瑣。分子生物學定量法是從微生物的基因水平上進行鑒別，其優點是精確、高效，但該方法局限性較大，如操作復雜、費時費力、試劑昂貴等。機器視覺技術是近些年來興起的一種基于視覺算法的新興計數，該方法主要是通過微生物紋理、顏色等特征信息，從形態學角度進行一系列的處理以達到分割計數的效果，具有簡單、快速、高效等優點，但仍然存在較大的缺陷，如對于光照、相機、算法要求較高等。

高光成像技術結合傳統的光譜分析技術與圖像分析技術于一體，能夠同時捕獲樣本的光譜信息與空間位置信息，是近些年來在食品品質安全監測應用中新興的一門快速無損檢測技術[17]。菌落在生長繁殖過程中，外部結構（形狀、紋理）和內部結構（結構、成分）均會發生一定的改變[18]。高光譜對菌落內部含氫基團較為敏感[19]，由于不同菌種具有不同內部組分含量，因此可通過提取圖像中像素點的光譜信息以達到鑒別及計數的目的，然而利用高光譜技術實現對益生菌酸奶中益生菌的鑒別計數研究鮮有報道。因此本實驗采用高光譜技術對益生菌酸奶中各類益生菌進行鑒別及計數，解決混合發酵益生菌酸奶中多種益生菌同時存在的情況下對每種益生菌數量計數的難題，為快速、無損判斷各類益生菌酸奶益生功能活性提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養基

菌種：實驗所用菌株保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophiles）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、干酪乳桿菌（Lactobacillu caseii）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）均購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。

培養基：實驗所用MRS培養基參照GB 4789.35—2016《食品微生物檢驗 乳酸菌檢驗》附錄A規定制備，MC培養基配方參照GB 4789.35—2016，LC培養基的配制參考文獻[20]方法，麥芽糖-MRS培養基和山梨醇-MRS培養基的制備參照文獻[21]，MRS和AC培養基的配制按照文獻[22]方法。

1.2 儀器與設備

高光譜圖像采集系統由江蘇大學組裝搭建[23]，主要零部件包括高光譜攝像機（ImSpector，V10E，芬蘭）、150 W的光纖鹵素燈（Fiber-Lite DC950Illuminator，DolanJenner Industries Inc，MA，美國）、精密電控移動平臺（Zolix，SC30021A，北京）、軟件系統為SpectralCube軟件（芬蘭Spectral Imaging有限公司提供）、光譜提取軟件為ENVI 4.5（V.4.5，Research System Inc boulder CO. USA）。

LD-2A離心機 北京京力離心機有限公司；HI 2214 ORP Meter 2011 pH計 哈納儀器有限公司；GHP-9050隔水式培養箱 上海合恒儀器設備有限公司；HYL-C小型組合式搖床 太倉市強樂實驗設備有限公司；SW-CJ-1D單人凈化工作臺 浙江蘇凈凈化設備有限公司；BCD-216SDN冰箱 海爾集團；AB123電子天平上海豪晟科學儀器有限公司；DSX-280B手提式壓力蒸汽滅菌器 上海珂淮儀器有限公司；XTL-165-VT數碼光學顯微鏡 鳳凰光學集團有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌落高光譜數據的采集及標定

1.3.1.1 菌種的培養

將需要滅菌處理的相關材料進行高壓滅菌處理（121 ℃，20 min），并將其轉移至超凈工作臺中。然后將經過擴增培養的各菌液用0.85%生理鹽水進行梯度稀釋，選擇2 種合適的稀釋梯度（生長出的菌落數量在30～300 CFU之間）進行涂布，每個涂布濃度平行4 次，得到5 種菌總共40 個平板，5 個批次培養后得到5 種菌總共200 個培養皿。此類培養皿中生長出的菌落供后期提取菌落光譜信息使用，傳統方法計數的培養按照參考文獻[20-22]方法進行培養和計數。

1.3.1.2 高光譜的采集與標定

高光譜攝像頭的分辨率為775×1 628，高光譜的波長范圍為432～963 nm，最終得到一個大小為775×1 628×618的高光譜數據塊。在進行光譜采集時可能會出現由于打光不均勻導致光照強度在各個波段的不同以及傳感器中暗電流的存在，所獲取的高光譜圖像在光照強度較弱的波段出現較大的噪聲，而且會在不同波長下光譜圖像出現亮度差異較大等情況[24]。因此在圖像采集完成后需要對光譜圖像進行黑白板校正[25]，校正公式如下式所示：

式中：Iλ為樣品原始高光譜圖像中λ波段對應的反射強度；Bλ為高光譜黑板校正圖像中λ波段對應的反射強度；Wλ為高光譜白板校正圖像中λ波段對應的反射強度；Rλ為樣品校正后高光譜圖像中λ波段對應的反射強度。

1.3.2 高光譜信息的提取與數據處理

1.3.2.1 高光譜信息的提取

圖像采集并標定完后，采用ENVI軟件進行特征光譜信息的提取[26]。所選對象菌落生長較好、大而厚實，定義一個圓形感興趣區域，提取此感興趣區域在不同波長下的光譜信息。采集培養皿中5 個單獨菌落的光譜數據并取平均值得到一條原始光譜，以此方式得到200 個培養皿對應的200 條光譜數據。

1.3.2.2 高光譜信息的預處理

菌落的感興趣區域除包含一些可進行樣本表征的有利信息外，通常受環境、機器運行狀況等影響，會攜帶一些樣本信息以外的光譜信息，如基線漂移、高頻噪聲、背景信息等，都會嚴重干擾實驗結果，因此有必要對所獲的光譜區域進行光譜預處理，除去光譜中無用光譜信息、降低噪聲干擾、減少基線漂移提高建立模型的準確性和穩定性[27]。本研究采用標準正態變量變換（standard normal variate transformation，SNV）、一階導數、二階導數、多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）4 種方法進行光譜預處理[28]，通過比較4 種方法處理后的效果，選出最優方法作為本實驗的預處理方法。

1.3.2.3 主成分分析（principal component analysis，PCA）

高光譜信息中除了含有大量的噪聲以外，還存在著大量的無關變量或重疊信息。為降低眾多信息中共存、相互重疊的信息，本研究采用PCA法對光譜數據進行降維處理。

1.3.3 菌落計數模型的建立

本實驗通過建立K-最近鄰法（K-nearest neighbors，KNN）、誤差反向傳播神經網絡（back propagationartificial neural network，BP-ANN）、最小二乘支持向量機（least squares support vector machines，LS-SVM）3 種模型，對比3 種模型識別率判斷最佳的計數模型。由于主成分數對KNN模型的識別結果具有較大影響，本實驗選取前10 個主成分和10 個K值對模型進行優化。BPANN模型的輸出層單元設為5 個（菌落種類），傳遞函數為雙曲線正切函數，初始權重為0.95，學習因子和動量因子均為0.1，收斂誤差設置為0.000 2，訓練迭代次數為1 500 次。采用交叉驗證和網格搜索法對LS-SVM模型的最佳參數進行選擇，以校正集交叉驗證均方根誤差最小為指標確定最優的徑向基核正規劃參數γ和基于徑向基核函數的參數σ2，經過優化得到，最佳主成分為4時，最佳參數γ為2.358 5，σ2為1.302 1。將經過預處理后的200 條光譜數據集按照K-S（Kennard-Stone）法分成125 個校正集和75 個預測集分別建立KNN模型、BP-ANN模型和LS-SVM模型，校正集數據用來建立模型，預測集用來檢測模型的準確性，通過比較3 種模型的識別率和最佳主成分數優選出最佳計數模型。模型的識別結果將5 種菌落分別分為1、2、3、4、5 類，每條光譜對應著一個模式識別編號。編號1為保加利亞乳桿菌，編號2為干酪乳桿菌，編號3為嗜熱鏈球菌，編號4為嗜酸乳桿菌，編號5為植物乳桿菌。統計編號1、2、3、4、5的數量，即對應著不同菌落的數量，具體流程詳見圖1。

1.3.4 益生菌酸奶中各種菌落數量及總數的確定

1.3.4.1 益生菌酸奶的制備

益生菌酸奶的制備參照文獻[8]方法進行。

圖1 高光譜菌落計數流程Fig. 1 Flow chart showing the process of colony counting using hyperspectral imaging

1.3.4.2 基于高光譜技術的模式識別法同時計數各種菌落及總數

取出部分自制酸奶樣品，用0.85%生理鹽水稀釋至10－8，經過大量預實驗表明10－6、10－7兩個濃度梯度生長的菌落數量在30～300 CFU之間，因此選擇10－6、10－7兩個濃度梯度作為涂布濃度。吸取該稀釋濃度的菌液0.1 mL均勻涂布在MRS培養基上，置于（36±1）℃恒溫培養箱內培養48 h后取出。提取混合菌落中每一株菌落的光譜信息，按照1.3.1、1.3.2節方法進行光譜的提取和預處理操作，最后將處理后的光譜數據集代入1.3.3節中已建立好的光譜模型中，根據菌落的識別結果統計每一種菌的數量。識別結果中5 種編號的總和為酸奶中菌落總和，編號2、4、5的和為自制酸奶中益生菌的總和。

1.3.4.3 傳統培養計數方法計數

采用上述相同的濃度梯度進行不同菌落的傳統方法計數。嗜熱鏈球菌的計數按照GB 4789.35—2016中規定的MC培養基計數法計數，將稀釋后的菌液加入到無菌培養皿中，每個培養皿中加入15 mL MC培養基，（36±1）℃培養（72±3）h，將菌落中等偏小、邊緣整齊平滑的紅色菌落計數為嗜熱鏈球菌；干酪乳桿菌的計數按照文獻[20]規定的選擇性培養基-LC培養基計數，具體為取稀釋菌液于LC培養基中涂布，然后在（25±1）℃培養（72±3）h，計數培養基上生長出來的菌落記為干酪乳桿菌數量；嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌的數量按照文獻[21]所描述的方法進行計數，采用山梨醇-MRS培養基計數植物乳桿菌的數量，麥芽糖-MRS培養基計數植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌的數量，然后兩者的差值即為嗜酸乳桿菌的數量；按照文獻[22]中的酸化MRS培養基在厭氧的培養環境下計數保加利亞乳桿菌的數量。

實驗過程中2 種方法在涂布時保證為同一批稀釋度樣品，且涂布量相同，每份樣品平行10 次，記錄各菌落的數量，將2種方法進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 光譜預處理及PCA結果

2.1.1 光譜預處理結果

圖2 不同預處理方法后的菌落樣本的光譜曲線Fig. 2 Hyperspectral curves of colony samples with different pretreatments

采用SNV、MSC、一階導數、二階導數4 種不同的預處理方法對618 個波長下的全光譜數據集進行預處理。預處理后的各菌落光譜曲線如圖2所示。根據4 種預處理得到的光譜曲線去噪效果來看，SNV預處理后的光譜曲線明顯較其他幾種預處理的光譜曲線平滑，其原因可能在于SNV預處理在消除樣本顆粒大小、散射或光程引起的樣本間光譜誤差效果較好。雖然MSC在處理校正散射方面較強，但在其他噪聲方面不足，求導處理后的光譜曲線更注重的是確定吸收峰和肩峰的位置，提高光譜的靈敏度和光譜細節，而在降噪方面略顯不足[29-30]。但是合適預處理方法的判定仍需要綜合模型的識別率進行選擇。

由表1可以看出，SNV預處理后的光譜模型識別效果優于其他預處理后的模型，可以有效對光譜中的噪聲和其他干擾進行校正。因此本研究在后續的實驗中均采用SNV預處理方法。

表1 不同預處理方法對模型效果的結果分析Table 1 Comparison of different spectral preprocessing methods

2.1.2 PCA結果

圖3 三維主成分空間分布圖Fig. 3 Three-dimensional projection from principal component analysis

由圖3可知，第1主成分代表了77.03%的光譜信息，第2主成分代表了5.15%的光譜信息，第3主成分代表了4.88%的光譜信息，前3 主成分的累計貢獻率達到85%以上，能夠代表光譜中的大多數信息。根據各菌落在三維主成分中的分布來看，幾種菌落均具備明顯的聚類特征，暗示了菌落與菌落之間具備一定的類別特征。其中干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌3 種菌落的區別特征較為明顯，能很好地與其他菌落進行區分。保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌2 種菌落重疊較為嚴重，其原因可能是這2 種菌落均為發酵菌種，且兩者之間存在共生作用，具有相似的代謝物，因此需要通過進一步建立模型進行鑒別區分。

2.2 最優計數模型選擇結果

將200 條光譜數據集按照K-S方法隨機分成125 條校正集光譜和75 條預測集光譜，分別建立KNN、BPANN、LS-SVM模型，模型的識別結果如表2所示。當主成分為9時，LS-SVM模型的識別率高于另外2 種模型，模型的綜合識別率中校正集識別率為99.20%，預測集識別率為93.33%，為最優計數模型。KNN模型識別率相對于LS-SVM識別率低的原因可能在于內部算法方面不足。KNN模型采用的是“表決”方法，按照同類樣本相互靠近和少數服從多數的原則進行表決，在解決不同種屬的樣本分類問題上效果較好，而在解決同種屬、不同類問題上效果較差[31]。在需要進行分類鑒定的幾種菌落中，保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌屬于相同的屬（乳桿菌屬）不同的種，因而區分率較低。盡管BP-ANN校正集的識別率達到了100%，但是在進行預測集驗證的時候識別率仍然很低，其原因可能是BP-ANN算法是一種按照誤差逆傳播算法訓練的多層前饋網絡，當輸出不等于期望輸出時則進入反向傳播過程，直到網絡的全局誤差小于給定的值后學習終止，實際上預測能力并沒有達到相應的水平，因此導致較低的識別率。LS-SVM是在經典SVM算法上進行改進，代替經典SVM中復雜的二次優化問題獲得支持向量，降低了計算的復雜性，加快求解速度，并且能夠在少量的訓練樣本中進行高維特征空間學習。從最佳主成分數量上來看，KNN模型具有最小的主成分數7，所建模型相對簡單，LS-SVM所建模型具有最大的主成分數，相對KNN和BPANN模型較復雜，權衡考慮計數模型的準確性，故本研究選取了識別率最高的LS-SVM模型作為最佳計數模型。

表2 不同模型的識別結果比較Table 2 Comparison of recognition results with different models

2.3 高光譜菌落計數法與傳統培養基計數法的比較

表3 2 種計數方法結果的比較Table 3 Comparison of two counting methods

由表3可知，2 種不同的計數方法結果較為接近，其中相同的菌落采用不同的計數方法得到的結果均未達到顯著性差異（P＞0.05），但高光譜計數法未能與傳統方法達到一致，其原因可能為：1）傳統的微生物計數法本身就是一個大約近似的方法，選擇性培養基并不是完全的具備選擇性；2）在實驗過程中存在著樣品均勻性、偶然性問題；3）高光譜數據在進行處理的過程中仍然存在較大的噪聲，導致在建立模型時，由于模型的精度不夠而導致的模型錯誤識別等。但就總體而言，2 種方法在益生菌總數的計數中沒有表現出較大的偏差，可以表明2 種方法在理論計數上無明顯差異。因此可以表明，高光譜計數法可以對酸奶中活性益生菌快速、無損、準確地進行計數，避免了傳統計數法對酸奶中活性益生菌技術需要不同培養基的繁瑣過程，滿足了實際生產和檢測工作中的需要。

3 結 論

本實驗運用高光譜技術實現對混合發酵酸奶中的發酵菌種（保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌）和益生菌種（干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌）的鑒別與計數。首先采集經過48 h培養的5 種菌種的高光譜信息，將得到的光譜信息分別采用不同的預處理方式（SNV、MSC、一階導數、二階導數）進行預處理降噪，采用PCA法對預處理后的光譜數據集進行降維，采用不同的模式識別方法建立5 種菌落的快速計數模型，根據幾種模型的識別率確定最佳的計數模型。最后培養自制酸奶樣品，對比高光譜菌落計數與傳統培養計數法，判斷高光譜菌落計數的可行性。結果表明，采用SNV預處理后的光譜在提高模型精度效果上最佳。當主成分數為9時，LS-SVM模型所對應的校正集識別率為99.20%，預測集識別率為93.33%，模型的識別率和穩定性為最佳計數模型。對比最佳模型菌落計數和傳統計數法對自制酸奶中各種益生菌的計數結果，二者并無顯著性差異（P＞0.05），驗證了高光譜技術對混合發酵酸奶中多種菌種同時存在情況下對每種益生菌同時計數方法的可行性。