輻照提高人工濕地美人蕉抗寒性及其越冬效果研究

鄭文萍 童偉軍 馬 琳 張 義 吳振斌 賀 鋒

(1. 中國科學院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049;3. 武漢理工大學, 武漢 430070)

人工濕地是一種高效的水質(zhì)改善系統(tǒng), 作為人工濕地重要組成部分之一, 濕地植物起著至關(guān)重要的作用。在人工濕地系統(tǒng)中, 植物有以下作用: 攔截大顆粒物質(zhì)、吸收營養(yǎng)物質(zhì)、強化微生物活性、加強水利傳輸?shù)萚1—3]。但是大多濕地植物都是草本植物, 到了氣溫低下的冬天, 會進入休眠期, 甚至枯萎死亡, 從而導致人工濕地系統(tǒng)污水凈化效率下降[4—6], 這嚴重制約了人工濕地系統(tǒng)在寒冷地區(qū)的推廣應(yīng)用[7,8], 所以提高濕地植物的抗寒性刻不容緩。

目前提高植物抗寒性的方法主要有抗寒栽培技術(shù)、基因工程、雜交育種和誘變育種等。其中,輻射誘變育種技術(shù)的優(yōu)點包括突變率高、育種周期短、操作簡單、生物安全性高等, 被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、園藝、藥材等領(lǐng)域, 并且已經(jīng)取得了一定進展。早期的研究發(fā)現(xiàn), 低劑量的γ射線照射種子可以提高番茄(Lycopersicon esculentumMill.)的出苗率和幼苗的抗病性[9]。低劑量γ射線照射能夠促進水稻(Oryza sativaL.)和綠豆(Vigna radiata(Linn.)Wilczek)的生長, 輻照后的水稻和綠豆長得更高, 穗數(shù)更多, 果莢更多, 顆粒更飽滿[10]。有研究發(fā)現(xiàn), 輻照處理后的水稻在鹽脅迫下生長更旺盛, 生物量更大, 表明低劑量γ射線照射能夠增強植物的耐鹽性[11]。Hamad等[12]研究發(fā)現(xiàn), 低劑量γ射線能夠減輕重金屬鎘脅迫對蘿卜植株生長的影響, 表現(xiàn)為促進種子萌發(fā)和幼苗生長。此外, 經(jīng)過20 Gy γ射線輻照的大豆種子, 幼苗耐旱性更好, 產(chǎn)量更高[13]。眾多研究表明, 低劑量γ射線對植物生長發(fā)育有積極的生物學效應(yīng), 但目前關(guān)于輻射誘導提高濕地植物抗寒性的研究還未見報道。因此, 有必要對輻射后的濕地植物在低溫下的生理反應(yīng)進行研究。

美人蕉(Canna indicaL.)屬多年生植物, 具有生長快、生物量大、適應(yīng)能力強等特點, 被廣泛應(yīng)用于人工濕地系統(tǒng)。然而, 迄今為止, 沒有相關(guān)研究表明γ射線能夠提高美人蕉的耐寒性, 從而提高人工濕地在低溫狀態(tài)下的凈化效果。本研究將輻照誘變育種技術(shù)應(yīng)用于濕地美人蕉, 為其抗寒育種提供一定理論基礎(chǔ), 并將抗寒性得到提高的美人蕉種植于人工濕地, 為突破人工濕地越冬瓶頸提供新思路。

1 材料與方法

1.1 植物處理與栽培

黃花美人蕉種子在湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所進行輻照處理, 輻射源采用60Co-γ, 劑量率為6 Gy/min劑量梯度設(shè)置為25、45、60 Gy, 未輻照組作為空白, 用0表示。輻照后的種子用熱水浸泡24h后種植于普通泥土中, 待種子萌發(fā), 幼苗長至30 cm左右高后, 取長勢相近的美人蕉幼苗移植于塑料盆中, 每組設(shè)置3個平行。

將盆栽美人蕉置于低溫光照培養(yǎng)箱中進行階段性降溫培養(yǎng), 溫度梯度設(shè)置為20℃、15℃、10℃、5℃和0, 每個溫度持續(xù)3d, 3d后降溫到下一溫度, 同時采集美人蕉葉片用于生理生化指標的測定。

1.2 植物生理生化指標測定

SOD測定采用氮藍四唑法、CAT測定采用過氧化氫比色法、POD采用愈創(chuàng)木酚法、丙二醛測定采用硫代巴比妥酸法、脯氨酸采用茚三酮顯色法、總可溶性糖采用蒽酮-硫酸比色法、可溶性蛋白質(zhì)采用考馬斯亮藍G-250法[14]。

1.3 抗寒性系數(shù)

α=A/ACK

A是5℃下各指標的測量值。ACK是20℃下的測量值。

1.4 試驗裝置與方法

本研究采用垂直流人工濕地, 裝置為20 cm×20 cm×40 cm的長方體玻璃鋼(四周及底涂黑), 裝置內(nèi)填充粒徑2—5 mm的沸石, 填充高度為35 cm。試驗設(shè)置2個處理水平, 2組分別種植未輻照處理的美人蕉和45 Gy輻照美人蕉, 每個裝置內(nèi)種植一株美人蕉, 種植深度10 cm (圖 1)。

進水采用自配水, 配方如下: 蛋白胨, 80 g/m3;牛肉膏, 55 g/m3; 葡萄糖, 100 g/m3; NaCl, 3.5 g/m3;NH4Cl, 28.5 g/m3; CaCl2, 2 g/m3; MgSO4, 1 g/m3;K2HPO4, 19 g/m3。主要指標為COD (195.4±22.7) mg/L; TN (22.84±1.42) mg/L; TP (2.47±0.33) mg/L。進水方式采用序批式, 水力停留時間為3d。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用單因素方差分析對植物生理生化指標進行比較分析, 為了綜合分析各生理指標間的關(guān)系, 對各指標進行因子分析。用獨立樣本T檢驗和Mann-WhitneyU檢驗對輻照組和對照組人工濕地的污染物去除率進行比較, 各分析的顯著性水平為P＜0.05。統(tǒng)計分析軟件用SPSS 17.0, 用Origin8繪制相關(guān)圖形。

圖 1 試驗裝置圖Fig. 1 Illustration of test installation

2 結(jié)果

2.1 各輻照組抗寒性評價結(jié)果

不同溫度下各處理組抗氧化酶活性變化由圖 2可知, 當T≥10℃時, 各組間SOD活性沒有顯著性差異, 當溫度降至5℃及以下時, 45 Gy及60 Gy輻照組活性顯著性高于對照組(P＜0.05), 在0℃下。從整體上看, CAT活性隨著溫度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, 在20℃、15℃、5℃下, 經(jīng)過輻照處理的美人蕉CAT活性顯著高于未輻照組(P＜0.05), 而當溫度降至0℃時, 各組CAT活性均急劇下降至趨近于0。在20℃下, 對照組POD活性顯著高于其他輻照處理組, 隨著溫度的不斷降低, 這種差異不斷縮小,而當溫度降至5℃時, 除25 Gy組外, 其他輻照組POD活性均顯著高于對照組, 其中45 Gy組活性最高。在0℃時25 Gy組和45 Gy組POD活性顯著性高于對照組。

在不同溫度下各處理組膜質(zhì)過氧化程度變化

本研究MDA的測定結(jié)果如圖 3所示。當T≥10℃時, 丙二醛含量幾乎不變, 輻照組與未處理組間無顯著性差異。當溫度降至5℃和0℃時, 對照組MDA大量積累, 輻照處理組MDA含量顯著低于對照組。

圖 2 在不同溫度下不同輻照劑量對美人蕉SOD (a)、CAT(b)和POD (c)活性的影響Fig. 2 Effects of different irradiation doses on activities of SOD(a), CAT (b), and POD (c) in CIL seeds under different temperatures

不同溫度下各處理組滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)變化脯氨酸、總可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)的測定結(jié)果如圖 4所示, 隨著溫度的降低各組脯氨酸均有所積累, 而溫度降低至0℃時, 脯氨酸含量有所降低, 在10℃和5℃下, 45 Gy組含量顯著高于對照組。當溫度較高(T≥10℃)時, 各組總可溶性糖含量均處于較低水平, 當溫度降低至5℃時, 各組糖含量均有所增加, 輻照組含量顯著高于對照組, 在0℃下, 各組可溶性糖大量積累, 45 Gy和60 Gy組含量顯著高于對照組。對照組可溶性蛋白質(zhì)含量隨著溫度降低不斷降低, 而輻照處理組降低程度明顯低于對照組,在5℃下, 45 Gy組蛋白質(zhì)含量顯著高于對照組, 在0℃下, 各輻照處理組含量均顯著高于對照組, 其中45 Gy組含量最高。

圖 3 在不同溫度下不同輻照劑量對美人蕉丙二醛的影響Fig. 3 Effects of different irradiation doses on malondialdehyde in Canna indica L. under different temperatures

因子分析因子分析可以克服單項指標的局限性, 提高評價的客觀性、全面性和科學性。為了綜合評價各組抗寒性, 我們對各項指標進行標準化, 得到各組的抗寒性系數(shù), 然后應(yīng)用因子分析的統(tǒng)計分析方法對抗寒性系數(shù)進行了分析, 最終因子得分結(jié)果見表 1。結(jié)果表明, 輻照處理組得分明顯高于對照組, 其中45 Gy組得分最高。所以, 輻照處理美人蕉種子可以有效提高美人蕉的抗寒性, 最佳輻照劑量為25—45 Gy。

2.2 人工濕地低溫狀態(tài)下凈化效果

人工濕地運行期間實測溫度如圖 5所示, 處理和對照組TP、TN、COD去除率測定結(jié)果見圖 6。對TP去除率分析可知, 隨著時間的推移, 兩組去除率均呈下降趨勢, 可能是因為基質(zhì)吸附作用的減弱。種子輻照組的TP去除率一直顯著高于對照組(P＜0.05), 試驗期間對照組TP平均去除率為27.24%,種子輻照組平均去除率為42.51%, 是對照組的1.56倍。由TN去除率結(jié)果可知, 前期兩組TN去除率沒有顯著性差異且處于較平穩(wěn)狀態(tài), 而自最低溫度下降至零下開始(1月3日), 兩處理組TN去除率均有所下降, 種子輻照組的去除率略高于對照組。而對照組和輻照組間COD去除率沒有顯著性差異。

3 討論

3.1 各輻照組抗寒性比較分析

圖 4 在不同溫度下不同輻照劑量對美人蕉脯氨酸(a)、總可溶性糖(b)、可溶性蛋白質(zhì)(c)含量的影響Fig. 4 Effects of different irradiation doses on proline (a), total soluble sugar (b) and soluble protein (c) content in Canna indica L. under different temperatures

在通常情況下, 植物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除是保持動態(tài)平衡的, 當有外界條件影響或處于逆境時, 這種動態(tài)平衡被打破, 自由基大量積累。但自由基性質(zhì)極為活潑, 過多殘留體內(nèi)不能被及時清除時, 它們將會攻擊各種生物大分子, 引起DNA損傷、酶失活、脂質(zhì)氧化等問題, 進而導致生物體的生理病變。植物的抗氧化系統(tǒng), 是維持機體自由基產(chǎn)生和消除保持動態(tài)平衡的代謝系統(tǒng), 對植物體進行正常的生理活動有著十分重要的意義。植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)分為酶促清除系統(tǒng)和非酶促清除系統(tǒng), 酶促清除系統(tǒng)主要是指抗氧化酶類, 包括SOD、POD、CAT等, 它們可以增強植物的抗逆性[15—18]。作為活性氧清除系統(tǒng)中第一個發(fā)揮作用的酶, 當植物受到環(huán)境脅迫時, SOD作為一種細胞保護酶發(fā)揮作用。大量的實驗結(jié)果表明, 超氧化物歧化酶在提高植物耐寒性方面起著重要的作用[19]。在晚冬抗冷鍛煉中多年生牧草根中SOD和CAT的活力快速增加[20]。SOD和CAT不僅可以清除體內(nèi)過量的活性氧, 在細胞H2O2信號傳導中也扮演著重要角色[21,22]。POD作為活性較高的適應(yīng)性酶, 能夠反映植物的生長特性、代謝狀況和對外界環(huán)境的適應(yīng)性。有研究表明, 環(huán)境脅迫可以誘導POD活性的提高, 且POD活性高低與植物抗逆性密切相關(guān)[23]。對各組SOD酶活性測定發(fā)現(xiàn), 當溫度降至5℃時, 各組SOD活性有所增加, 而當溫度降至0℃時, 各組SOD活性明顯下降。在5℃, 隨著照射劑量的增加, SOD活性先升高后降低, 在45 Gy達到高峰。在0℃下也發(fā)現(xiàn)了同樣的趨勢。由此可以看出,輻照處理可以提高低溫下美人蕉SOD活性, 而SOD活性的提高有助于美人蕉抵御低溫傷害。當T≥5℃時, 輻照處理組美人蕉CAT活性一直高于對照組, 而當溫度降至0℃時, 各試驗組美人蕉CAT活性均急劇下降到趨近于0, 說明輻照處理對美人蕉的抗寒性提高有一定幫助, 但是當溫度達到0℃時,即使是經(jīng)過輻照處理的美人蕉也受到了很大的低溫傷害。在20℃下, 對照組POD活性顯著高于輻照組, 隨著溫度的降低對照組POD活性不斷降低, 輻照組活性反而有所增高, 在5℃下輻照組POD活性顯著高于對照組。結(jié)果表明, 輻照處理可提高低溫下美人蕉的POD活性, 從而消除低溫脅迫產(chǎn)生的多余ROS, 有助于抵御低溫傷害。

MDA是檢測低溫植物損傷的常用指標之一[24]。在低溫脅迫下, 植物產(chǎn)生大量活性氧自由基, 引發(fā)膜質(zhì)過氧化, 最終生成丙二醛[25], 且膜脂過氧化程度隨溫度下降而加重[26]。本研究結(jié)果表明, 在低溫下未輻照處理組膜質(zhì)過氧化程度更高, 輻照處理后的美人蕉抗寒性更高。

脯氨酸是可以保護植物免受單線態(tài)氧和自由基損傷的唯一的水溶性溶質(zhì), 它不僅可以結(jié)合單線態(tài)氧, 還可以有效地清除羥自由基, 穩(wěn)定蛋白質(zhì)、DNA和細胞膜[27,28]。有研究表明脯氨酸含量的增加可以提高煙葉(Nicotiana tabacumL.)的耐冷性[29]。脯氨酸的積累可以增加細胞液濃度, 起到保護細胞的作用[30]。此外, 脯氨酸能提高抗氧化酶的活性,有助于清除多余的活性氧。在低溫下輻照組脯氨酸含量高于對照組, 由此可見, 輻照處理組更能適應(yīng)低溫環(huán)境。已有研究表明, 植物抗寒性與可溶性糖含量密切相關(guān)[31], 本研究結(jié)果表明輻照可以提高美人蕉低溫下的糖含量, 從而減輕低溫帶來的傷害。可溶性蛋白具有較強的親水性, 可以和低分子量的糖一起聚集在葉綠體和細胞器周圍, 增強細胞的保水能力, 降低冰點, 防止細胞內(nèi)結(jié)冰。大多數(shù)研究表明, 蛋白質(zhì)含量的增加與植物抗寒性呈正相關(guān)[32]。本研究發(fā)現(xiàn), 在受到低溫脅迫時, 美人蕉蛋白質(zhì)含量會降低, 而輻照組降低程度小于對照組,在0℃下45 Gy輻照組蛋白質(zhì)含量顯著高于其他組。綜上所述, 輻照能夠提高美人蕉葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度, 從而提高美人蕉抗寒性。

表 1 各處理組美人蕉抗寒系數(shù)因子得分Tab. 1 Scores of cold resistance for CIL in each treatment group

圖 5 冬季應(yīng)用試驗期間溫度實測圖Fig. 5 Illustration of temperature measurement during winter

3.2 人工濕地低溫狀態(tài)下凈化效果比較分析

眾多研究表明冬季低溫對磷的去除影響較大,冬季TP的去除率比夏季低6.1%—34.0%[33]。輻照美人蕉顯著提高了人工濕地在冬季低溫下的TP去除率, 人工濕地對磷的去除主要靠基質(zhì)吸附、植物吸收以及微生物的同化[34]。已有研究表明, 用于二級處理植物吸收氮量約占去除量的8%—16%, 植物吸收去除氮的作用不明顯[35]。研究者普遍認為微生物的硝化/反硝化是人工濕地脫氮的主要途徑[36]。眾多研究者認為, 人工濕地即使在冬季低溫下對COD也有較高去除率[33], 在本研究中, 對照組和輻照組冬季COD去除率平均值均可達70%以上。

圖 6 45Gy種子輻照組和對照組冬季TP (a)、TN (b)和COD(c)去除率趨勢圖Fig. 6 Removal rates of TP (a), TN (b), and COD (c) in the group of CIL in constructed wetland by using 45 Gy dose of gamma ray and control group in winter

4 結(jié)論

輻照處理能夠提高低溫下美人蕉葉片中的抗氧化酶SOD、POD和CAT的活性, 提高脯氨酸、可溶性糖、蛋白質(zhì)含量, 降低丙二醛含量, 從而減少低溫帶來的生理損傷, 種子最佳輻照劑量為45 Gy,45 Gy輻照美人蕉種子能夠顯著提高人工濕地冬季TP去除率。