一株新型自絮凝凱式擬小球藻的兩步培養產油技術

趙 艷 汪 成 王超霞 王天圻

(浙江工商大學食品與生物工程學院, 杭州 310018)

以小球藻為代表的微藻是一類能進行光合自養生長的單細胞綠藻, 具有光合作用效率高、生長速度快、適合工業化養殖等優點, 微藻油脂含量比大豆、棕櫚樹、油菜等傳統油料作物更高, 可達到50%—70%細胞干重, 是生產生物柴油的優異可再生資源[1]。隨著化石能源逐漸耗竭, 微藻被認為是唯一可完全替代化石能源的生物柴油新原料[2]。獲取優良藻株和建立高效的人工培養技術體系是當前微藻生物柴油研發的重點, 其中藻細胞生物量、油脂含量和油脂產率是微藻培養中的3個關鍵參數[3]。理想的培養技術體系應保障藻細胞生物量和油脂含量同時達到峰值, 但實際上兩個指標通常難以同步, 因為生物量的提高通常依賴于營養物質的充足供應, 而脂質積累大多發生在營養元素限制的應激條件下[4]。為了解決上述矛盾, 研究者設計了兩步培養法[5,6], 即階段Ⅰ藻細胞在富營養培養基中快速生長達到較高生物量, 階段Ⅱ轉移至營養元素限制培養基以刺激藻細胞的油脂合成。Mujtaba等[7]通過補充CO2和低氮脅迫兩步培養法使普通小球藻的油脂產率提高到傳統單步培養法的2.45倍。李小妹等[8]報道兩步培養法使柵藻生物量和油脂含量分別比單步培養法提高了35.74%和近1倍。兩步培養法優勢明顯, 但尚處于探索階段。階段Ⅰ提高藻細胞生物量的方法包括添加有機碳源、通CO2氣體、補充激素、提高光照強度等[9,10], 其中添加葡萄糖能使微藻處于自養和異養共存的兼養模式, 既能提高藻細胞生物量, 又能顯著增加油脂含量, 從而大幅提高微藻油脂產率[11,12]。階段Ⅱ提高藻細胞油脂含量的理論基礎在于營養元素限制改變微藻的代謝模式并影響油脂合成, 具體方法包括氮、硫、磷等單種元素限制或稀釋培養基進行全營養元素限制等[4,13]。但藻種不同提高油脂產率所需的培養條件也不同, 如小球藻NJ-18在氮、磷限制時油脂產率較高[14], 普通小球藻CCALA256在全營養元素限制時油脂產率較高[15]。因此針對特定藻種進行兩步培養法的技術優化, 實現生物量與油脂含量的協同增效是構建微藻油脂生產體系的關鍵。此外, 由于微藻細胞體積小、收獲困難, 傳統的機械過濾和離心等物理收集方法的成本高達微藻油脂生產總成本的20%—30%, 化學絮凝收集法中絮凝劑的使用又會造成環境污染和生物毒害[16], 這無疑增加了兩步培養法的生產經濟成本, 限制了其應用。優良的自絮凝微藻在不添加任何絮凝劑的條件下即可自發絮凝, 易于收獲且無需增加額外經濟成本[17], 與兩步培養法結合, 有望成為解決微藻生物柴油生產技術瓶頸的新突破口。

本課題組篩選獲得一株凱式擬小球藻(Parachlorella kessleri)優良藻株F01, 自養條件下油脂含量達到30%左右, 且具有很強的自絮凝能力, 在微藻油脂生產方面應用潛力較大。本文針對兩步培養法的階段Ⅰ葡萄糖兼養培養和階段Ⅱ的元素限制處理條件進行技術優化, 為新型自絮凝凱式擬小球藻F01應用于生物柴油開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

凱式擬小球藻藻種F01由本實驗室從水生植物根際土壤分離鑒定并保存。

1.2 實驗設計

凱式擬小球藻F01的兩步培養法方案階段Ⅰ培養: 以BG11基礎培養基[18]為自養培養基作為單步培養對照, BG11中添加4種不同初始濃度(1、5、10和20 g/L)的葡萄糖作為兩步培養法的兼養培養基, 分裝到250 mL三角瓶中, 裝液量為100 mL。挑取單藻落純化后自養擴培至對數生長期的F01作為種子細胞, 藻細胞接種后初始濃度均為2×106cell/mL, 置于人工氣候箱內。培養條件為: 25℃, 光強40 μmol/(m2.s), 光周期中光暗比L∶D為12h∶12h, 每天早晚各搖動一次。每組設置3個平行, 培養周期為10d。

階段Ⅱ元素限制培養: 將階段Ⅰ兼養培養10d至穩定期的F01藻細胞按初始濃度1×107cell/mL轉接至元素限制培養基進行階段Ⅱ培養, 培養條件同階段Ⅰ。元素限制培養基以階段Ⅰ兼養培養基為基礎, 設置不同濃度起始碳源、氮源和營養元素及其相關組合, 具體包括: (1)糖限制組: 1/10 G低糖組, 即將階段Ⅰ兼養培養基中的葡萄糖濃度由10降低至1 g/L; 0 G無糖組, 即BG11基礎培養基。(2) 低糖低氮組: BG11基礎培養基中添加1 g/L的葡萄糖并將氮素硝酸鈉由1.5減少至0.5 g/L (1/10G+1/3N)。(3)無糖氮限制組: 1/3N低氮組, 即BG11基礎培養基中的硝酸鈉減為0.5 g/L; 0N無氮組,BG11基礎培養基中去除硝酸鈉。(4)全元素限制組: BG11基礎培養基稀釋為原來的1/3。

藻細胞計數和生物量測定階段Ⅰ和階段Ⅱ培養中分別每2d或1d取樣一次, 取樣時間均為光照10h后, 藻細胞濃度的測定采用血球計數法, 為了避免自絮凝特性對計數效果的影響, 取樣計數前將培養液震蕩搖勻保證計數準確性。離心收集適量藻細胞并烘干至恒重, 計算干重生物量和干重產率。

藻細胞油脂提取和含量的測定采用溶劑提取法和脂染色法對凱式擬小球藻油脂含量進行測定, 并建立凱式擬小球藻油脂含量與脂染色后吸光度在A645nm的線性回歸方程, 采用脂染色法測定培養過程中的油脂。溶劑提取法具體操作參考Zhao等[19]的方法, 脂染色法具體操作參照任潔等[20]的方法。

油脂產率按照如下公式計算:

F01藻細胞絮凝率測定參照Alam等[21]的方法并稍作修改。測定時搖動培養液以使藻細胞分散均勻, 然后將10 mL細胞懸浮液轉移到試管中搖勻并測定藻細胞總濃度A (cell/mL), 將培養液分別靜置0.5、1、2、3、6和12h后, 在距離液面頂部4 cm處取細胞懸液試樣, 測量試樣藻細胞濃度B(cell/mL)。絮凝率按照如下公式計算:

藻EPS的提取與三維熒光光譜分析小球藻胞外聚合物(Extracellular polymeric substances,EPS)的提取與分析參照Yang等[22]的方法。在培養周期結束后, 取藻細胞干重相當于0.1 g的微藻懸浮液, 8000 r/min離心10min, 棄上清, 用5 mL去離子水洗滌沉淀, 8000 r/min離心5min, 收集的微藻沉淀用5 mL去離子水懸浮并加熱至80°C, 水浴30min。隨后, 將混合物以8000 r/min離心10min, 將上清液用0.45 μm醋酸纖維素膜過濾, 濾液即EPS組分。

三維熒光光譜(3D-EEM)的測定條件參照Lv等[23]的方法。使用150 W氙弧燈為激發光源, 光電倍增管(PMT)電壓為700 V; 設定激發狹縫寬度為10 nm,發射狹縫寬度為1 nm。光譜儀掃描范圍為激發波長/發射波長(EX/EM)= 200—450 nm /250—550 nm,掃描速度為1200 nm/min。得到每個EX /EM所對應的熒光強度(Intensity, 單位: arbitary units, a.u.), 對所有數據點采用Origin9.0軟件進行處理, 形成等高線熒光光譜圖。

數據處理與統計分析每個實驗處理設3次重復, 各指標測定結果以x±s (平均數±標準誤)表示,應用SPSS22.0軟件對對照和各處理組數據進行方差分析,P＜0.05為差異顯著,P＜0.01為差異極顯著。采集數據利用Origin9.0軟件進行分析作圖。

2 結果

2.1 階段Ⅰ兼養培養對凱式擬小球藻F01生長和油脂含量的影響

與自養對照組相比, 兼養組中葡萄糖濃度在1—20 g/L內對F01促生長效應明顯(圖 1A)。培養8—10d, 添加5—20 g/L葡萄糖培養組藻細胞生長開始進入穩定期, 對照組仍處于對數期; 至10d培養期結束時, 所有兼養組藻細胞濃度均顯著(P＜0.05)高于對照組, 其中10和20 g/L葡萄糖兼養組藻細胞濃度較大, 分別為對照組的3.59倍和3.50倍, 二者差異不顯著。

第10天收獲藻細胞, 測定藻細胞的干重和油脂的含量, 結果如圖 1B, 兼養組藻細胞干重均顯著(P＜0.05)高于對照組, 其中10 g/L葡萄糖兼養組藻細胞干重達到3.54 g/L, 是對照組的6.94倍, 對比藻細胞濃度增幅(3.59倍)可知, 兼養培養促進藻細胞干物質積累效應更顯著。10 g/L葡萄糖兼養組藻細胞油脂含量57.7%, 同比是對照組的2.35倍, 說明兼養培養有利于藻細胞的生物量提高和油脂積累。綜合藻細胞生物量與油脂含量兩個指標, 選擇10 g/L葡萄糖作為階段Ⅰ兼養培養的優化碳源。由于第10天兼養組藻細胞生長到達穩定期, 故階段Ⅰ培養周期選擇為10d。

2.2 階段Ⅱ不同元素限制處理對凱式擬小球藻F01油脂產率的影響

階段Ⅰ兼養培養10d后的藻細胞轉接至元素限制培養基進行階段Ⅱ培養, 比較了葡萄糖限制、氮素限制和全元素限制等三類元素限制處理對F01藻細胞濃度(圖 2A)、干重(圖 2B)和油脂含量(圖 2C)的影響。結果表明, 三類營養元素限制處理對藻細胞的生物量和油脂含量影響較大, 顯著(P＜0.05)改變了藻細胞的油脂產率。轉接后的前2d, 所有處理組的藻細胞均快速生長, 但藻細胞油脂含量與轉接前起始含量(油脂含量57.7%)相比均出現明顯下降,第1天尤其明顯。這說明藻細胞從階段Ⅰ兼養富營養培養基中轉入階段Ⅱ的營養元素限制培養基后,短期內物質代謝發生了適應性調節變化。

葡萄糖限制在階段Ⅱ5d培養過程中, 低糖組(1/10 G)和無糖組(0 G)的藻細胞濃度(圖 2A)和干重(圖 2B)持續增長, 第4天均到達穩定期, 此時低糖組和無糖組的藻細胞濃度分別為初始轉接濃度的1.99和1.88倍, 二者差異不顯著, 但低糖組藻細胞干重(2.01 g/L)極顯著(P＜0.01)高于無糖組(1.48 g/L)。低糖組和無糖組的藻細胞油脂含量持續下降, 4d時低糖組油脂含量顯著(P＜0.05)高于無糖組。可見低糖限制處理比較利于藻細胞干重積累和油脂含量維持。

圖 1 階段Ⅰ兼養培養對凱式擬小球藻F01生物量和油脂含量的影響Fig. 1 The effect of mixotrophic conditions at stageⅠon cell concentration, biomass and lipid contents of Parachlorella kessleri F01

圖 2 階段Ⅱ培養對凱式擬小球藻F01細胞濃度(A)、干重(B)和油脂含量(C)的影響Fig. 2 Effect of stage Ⅱ culture conditions on cell concentration (A), biomass (B) and lipid contents (C) of Parachlorella kessleri F01

氮素限制氮素限制處理(1/3N和0N)對F01細胞濃度和干重的影響與低糖處理組類似(圖 2A和2B), 總體上介于葡萄糖限制處理和全元素限制處理之間, 且低氮組均顯著(P＜0.05)高于無氮組,4d穩定期時低氮組細胞干重為無氮組的1.28倍。轉接后前2d, 氮限制處理組藻細胞油脂含量下降幅度比葡萄糖限制組更大, 但分別于第2和第3天達到最低值, 之后開始回升。4d時低氮組油脂含量回升至41.3%, 超過無糖組, 同比與低糖組(40.2%)類似, 相當于轉接前起始含量的71.5%; 無氮組油脂含量也回升至與無糖組相當的水平。藻細胞油脂含量出現回升拐點是氮素限制處理的顯著特征。

全元素限制采用1/3 BG11培養基進行全元素限制處理時, 藻細胞濃度和干重增長最為緩慢,4d時到達1.63E+07 cell/mL和1.04 g/L (圖 2A和2B),比初始轉接時分別增加了63.0%和48.6%, 達到顯著差異(P＜0.05)水平。藻細胞油脂含量變化趨勢與低氮組相似(圖 2C), 回升拐點出現在第2天, 4d時藻細胞油脂含量與無糖組、無氮組相近, 無顯著性差異。

低糖低氮協同處理基于上述低糖處理提高藻細胞干重生物量和低氮處理后藻細胞油脂含量出現回升拐點的實驗結果, 設計考察了低糖與低氮協同處理(1/3N+1/10G)對藻細胞生物量、油脂含量的影響, 結果(圖 3)發現在協同處理后, 藻細胞干重和油脂含量變化趨勢與低氮組類似, 但同比介于低糖組與無糖組之間, 效果低于低糖處理組。

2.3 兩步培養法提高凱式擬小球藻F01油脂產率的效果評價

圖 3 低糖與低氮協同處理對凱式擬小球藻F01干重與油脂含量的影響Fig. 3 Effect of low glucose and low nitrogen co-treatment on biomass and lipid contents of Parachlorella kessleri F01

收獲期藻細胞干重和油脂含量決定了其最終的油脂產量, 而與培養時間關聯的油脂產率反映了平均每日的油脂收益。由于階段Ⅱ處理后藻細胞生物量逐漸增加并于4d達到穩定期, 而油脂含量有所下降, 綜合考慮, 將單步培養法和兩步培養法階段Ⅱ處理1d和4d后收獲的藻細胞油脂產量及油脂產率總結于表 1。可知單步法自養對照組的油脂產率僅為12.61 mg/(L.d), 兩步培養法經階段Ⅰ兼養后藻細胞油脂產量(2.04 g/L)和油脂產率[204.25 mg/(L.d)], 分別是對照組的15.69倍和16.20倍, 增效十分顯著。經階段Ⅱ的6種元素限制處理后, F01油脂產量和油脂產率出現較大變化, 雖然與單步法相比所有處理組藻細胞的油脂產量和產率均極顯著(P＜0.01)增加, 但與階段Ⅰ相比出現了增效與減產兩種技術結果。其中無氮組和全元素限制組油脂產量和油脂產率均顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)低于階段Ⅰ, 說明這兩種處理效果不佳。而低糖、無糖、低糖低氮組在處理1d時都顯著提高了F01的油脂產量, 并且4d時增效更顯著。其中低糖低氮協同處理4d后的油脂產量最高, 達到3.08 g/L, 同比是低氮組的1.39倍, 比單獨階段Ⅰ油脂產量增加了51.0%, 比單步法對照組增加了22.69倍。從油脂產率看, 階段Ⅱ低糖組處理1d的效果最佳, 達到242.64 mg/(L.d), 比階段Ⅰ提高了18.8%, 達到了單步法的19.24倍, 其次是低糖低氮協同處理組, 處理1d和4d的油脂產率均顯著高于階段Ⅰ, 增加幅度分別為11.4%和15.4%, 其他不添加葡萄糖的處理組油脂產率均顯著(P＜0.05)低于階段Ⅰ, 說明葡萄糖兼養是影響F01的油脂產率的主要因素。

綜上, 兩步培養法對凱式擬小球藻F01的油脂生產促進效果明顯, 階段Ⅰ兼養培養大幅提高了藻細胞的油脂產量和產率, 階段Ⅱ低糖處理和低糖低氮協同處理對進一步提高油脂產量和產率效果最佳。

2.4 兩步培養法對凱氏擬小球藻F01自絮凝性能的影響

收獲期F01自絮凝率分析在培養過程中,凱式擬小球藻自絮凝能力很強, 藻細胞沉淀在培養瓶底部, 需人工振蕩才能懸浮起來。對照組培養10d的培養液靜置12h, 絮凝率為90.34%, 說明F01具有良好的自絮凝性能。

兩步培養法階段Ⅰ培養結束時藻細胞自絮凝率為96.11%, 與對照組差異不顯著。階段Ⅱ中6種方式處理1d和4d后的藻細胞絮凝率結果如表 2。可見階段Ⅱ處理后藻細胞的自絮凝率有所下降, 且4d時藻細胞的絮凝率同比1d時下降幅度較大, 但所有處理組藻細胞絮凝率均在80.0%以上。各處理組絮凝能力由大到小分別為: 低糖組＞低糖低氮組＞無糖組＞低氮組＞無氮組＞全元素限制組, 特別是對油脂產量和油脂產率具有顯著增效作用的低糖、無糖、低氮、低糖低氮處理組的藻細胞絮凝率基本在85.0%以上, 雖然與對照組或階段Ⅰ的差異達到顯著(P＜0.05)水平, 但仍能滿足自絮凝收獲的要求,收獲后上清液中剩余的藻細胞還可以作為下批次培養的種子細胞進行循環利用, 無需額外增加經濟成本。

收獲期F01藻細胞EPS的組分分析藻細胞絮凝性能主要與EPS的組分和含量有關, 圖 4顯示單步法對照組、兩步培養法階段Ⅰ和階段Ⅱ全元素限制處理4d后藻細胞EPS的三維熒光圖譜, 可知所有組藻細胞的EPS掃描均在區域T存在一個主峰(Ex/Em: 280/355 nm), 特征熒光峰的范圍基本相同。Chen等[24]對廢水中微生物胞外可溶性產物的三維熒光光譜特征進行了詳細研究, 建立了三維熒光圖譜區域與不同類型有機物的對應關系, 本文在相同試驗條件下主要參照文獻的信息采用積分區域方法對試驗藻細胞EPS的三維熒光光譜圖進行解析, 可推測譜圖T區域溶解性藻細胞產物主要為蛋白樣類色氨酸物質, 由于色氨酸含有疏水性基團,EPS中蛋白樣類色氨酸物質含量高可能是凱式擬小球藻F01具有良好絮凝性能的原因。圖 4峰T強度大小排列順序為B＞A＞C, 對應表 2藻細胞的自絮凝率大小排序為96.11%＞90.34%＞82.07%。統計F01對照組、階段Ⅰ和Ⅱ處理不同天數后藻細胞EPS的峰T強度列于表 2, 進一步說明EPS中蛋白類色氨酸物質含量高低與藻細胞絮凝率大小之間確實存在正相關。兩步培養法的不同培養基組成通過改變藻細胞EPS蛋白類色氨酸物質的含量而影響了其絮凝性能。

表 1 兩步培養法對凱式擬小球藻F01油脂產量和產率的影響Tab. 1 Effect of two-step culture on lipid production and lipid productivity of Parachlorella kessleri F01

表 2 兩步培養法對凱式擬小球藻F01絮凝性能的影響Tab. 2 The effect of flocculating ability of Parachlorella kessleri F01 in culture under two-step culture

3 討論

本文采用的新型凱式擬小球藻F01具有光合自養與兼養生長的能力, 兩步培養法階段Ⅰ添加葡萄糖兼養培養顯著提升了藻細胞生物量與油脂含量,10d收獲時藻油脂含量為57.7% (圖 1), 達到大多數傳統產油微藻(如普通小球藻、斜生柵藻、富油新綠藻)在條件綜合優化后的40%—60%的油脂含量[4]。黃冠華等[5,25]報道蛋白核小球藻和普通小球藻兩步培養法中階段Ⅰ的最適葡萄糖用量為20 g/L,培養周期15d, 使油脂產率最大提高約2倍。Mujtabao等[7]和Ho等[26]報道產油微藻普通小球藻和斜生柵藻在兩步法培養后的油脂產率介于70—80 mg/L/d之間。本文中凱式擬小球藻F01階段Ⅰ兼養的最適葡萄糖濃度為10 g/L, 兩步培養法的階段Ⅱ低糖組處理1d的最大油脂產率最高達到242.64 mg/(L.d)(表 1), 是單步培養法對照組的19.24倍, 優勢顯著,表明F01屬于生物柴油生產的優良潛力藻種。

油脂產率指標綜合反映生產期內每天的油脂收益, 受收獲藻細胞干重、油脂含量和培養周期的影響, 通過分解這3個重要參數可考察其對油脂產率貢獻的大小。本文發現階段Ⅱ的不同營養元素限制處理對F01油脂產率的影響機制存在差異, 其中1/10G低糖處理1 d油脂產率達到峰值(表 1)的原因在于藻細胞干重增長顯著且油脂含量相對階段Ⅰ而言下降幅度較小, 說明該過程中藻細胞干重增加貢獻最大。除了全元素限制處理組外, 階段Ⅱ所有處理組的藻細胞在轉接后立即開始快速生長(圖 2)。這與Ho等[26]在斜生柵藻兩步培養中的研究結論不同, 斜生柵藻在階段Ⅰ通入二氧化碳的培養中生長迅速, 進入階段Ⅱ營養元素限制處理后藻細胞生長緩慢, 但油脂含量明顯提高, 最終油脂產率[78.73 mg/(L.d)]約為階段Ⅰ的2倍。原因可能是本文階段Ⅰ葡萄糖兼養后F01藻細胞本身的生化組分含量豐富, 能迅速適應新的培養環境。綜合分析階段Ⅰ葡萄糖兼養對藻細胞干重和油脂含量大幅提升, 以及階段Ⅱ低糖組、低糖低氮組油脂產率或產量較高(表 1)的技術效果, 可知補充有機碳源葡萄糖對F01藻種的生長和油脂合成極為有利, 但直接添加葡萄糖的成本較高。營養素限制處理的成本較低, 其中氮素限制處理應用最為廣泛, 但技術效益隨藻種、環境條件和培養方式變化很大[13]。Li等[27]在自養條件下對凱式擬小球藻(CCALA255)進行低氮處理, 4d內藻細胞油脂含量逐漸上升。本文中低氮、無氮、低糖低氮協同處理5d內藻細胞油脂含量均出現先下降后回升的拐點現象(圖2C),而生物量隨培養時間延長逐步增加至穩定期(圖2A), 說明氮素限制處理條件下F01在生物量增長與油脂合成積累并不同步。可見針對特定藻種通過基礎研究選擇微藻生物量與油脂含量的最佳平衡點極為重要, 油脂產量和產率指標技術含義不同,需要根據生產工藝和成本核算進行優化篩選。此外, Fu等[28]報道小球藻(Chlorella regularis)在葡萄糖異養培養和氮饑餓脅迫共同作用時, 充足的磷元素使藻細胞油脂含量和產率分別達到對照組的2倍和1.3倍, Fernandes等[29]報道采用CO2通氣、元素限制培養處理和光照條件綜合優化后的兩步培養技術能使凱式擬小球藻(CCALA255)藻細胞油脂含量提高4—5倍, 油脂產率最高達340 mg/(L.d)。磷元素及其他條件的優化是否能進一步提升F01的產油效益值得進一步探究。

圖 4 凱式擬小球藻F01 的EPS三維熒光光譜Fig. 4 3D-EEM spectra of EPS of Parachlorella kessleri F01(white slanting part of the spectrum was due to the scattering effect by water molecules

在微藻生物柴油生產技術中, 傳統的藻細胞收獲方法如離心分離等巨大的能量和成本消耗是工程化應用的主要限制, 尤其兩步培養法設計方案中,多通過離心過濾等方式來分別收獲兩個階段處理后的藻細胞, 會大幅度提高生產成本[7]。本文對照組F01藻細胞自絮凝率高達90%以上, 其EPS組分中疏水性的蛋白樣色氨酸含量高可能是其具有優良自絮凝性能的生化基礎, 兩步培養法不同處理組雖然通過改變EPS中蛋白類色氨酸組分的含量而影響藻細胞的絮凝率(圖 4和表 2), 但對油脂增效顯著的低糖、低氮等處理組的藻細胞自絮凝率基本在85.00%以上(表 2), 能滿足自絮凝收獲的要求, 無需增加收獲經濟成本, 這對兩步培養法生產微藻油脂而言是極為重要。

自絮凝凱式擬小球藻F01是生物柴油生產的優良潛力藻種, 兩步培養法能大幅提升其產油效益。產油微藻的自絮凝優勢與兩步培養法結合, 有望成為解決微藻生物柴油生產技術瓶頸的關鍵突破口。