羅伊氏乳桿菌對組胺引起黃顙魚肝腸損傷修復效果評價

成艷波 李 薇 韓木蘭 許國煥 謝黎煒 印遇龍 梁建慶

(1. 廣東省微生物研究所廣東省部共建華南應用微生物國家重點實驗室, 廣東省微生物應用新技術公共實驗室, 廣州 510070;2. 廣東碧德生物科技有限公司, 廣州 510663; 3. 中國科學院亞熱帶農業生態研究所, 長沙 410125)

組胺作為常見的一種生物胺, 廣泛存在于生物體內, 其作為一種重要的調控因子, 在機體生理功能調節中扮演著重要角色[1,2], 然而養殖動物攝入過高濃度的組胺往往會出現中毒癥狀[3]。已有研究報道, 組胺會引起水產動物生長性能下降[4,5], 組織器官出現炎癥反應、病理損傷[6—9]及體色變異[7]等。課題組前期研究發現, 攝食含組胺飼料(1000 mg/kg)的黃顙魚, 腦組織促腎上腺皮質激素和黑素皮質素受體基因表達量下降、表皮酪氨酸酶活力和黑色素含量降低, 最終導致體色白(體)化[10]; 同時伴隨有胃、肝臟和腸道發生病理損傷, 如胃部腫脹,肝臟炎癥細胞增多及腸道皺襞數量減少、長度變短等[11]。然而, 中等濃度組胺對黃顙魚生長性能及組織健康是否有影響, 尚不清楚。羅伊氏乳桿菌是已報道的幾乎存在于所有脊椎動物和哺乳動物腸道內的乳桿菌, 對養殖動物生長、免疫和腸道屏障功能有顯著的改善作用[12,13]。Ganesh等[14]報道, 羅伊氏乳桿菌可通過抑制甘油二酯激酶的磷酸化, 減輕組胺和組胺受體1結合介導的腸道炎癥反應, 被譽為“微生物抗組胺藥”。因此, 實驗模擬水產飼料中使用較多的中等魚粉的組胺含量, 研究中等濃度組胺對黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)生長及組織健康的影響, 同時對羅伊氏乳桿菌對飼料中組胺的脫毒效果進行評價。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

實驗以白魚粉(組胺含量147 mg/kg)和豆粕為主要蛋白源, 設計3組等氮飼料, 分別記為C、H和H+B。其中C為基礎飼料, H組飼料在基礎飼料配方中添加了400 mg/kg的外源組胺, 以模擬中等魚粉中組胺含量(GB/T 19164-2003); H+B組在基礎飼料配方中添加外源組胺的同時添加了羅伊氏乳桿菌,乳桿菌以菌懸液的形式添加(實測活菌數為108CFU/g), 添加量為20%, 即在1 kg混勻的飼料原料中添加200 g菌懸液。實驗用飼料原料經粉碎、過篩(40目)后, 制成直徑為3 mm的顆粒飼料(制粒機, 型號KL120, 中國水產科學研究院漁業機械儀器研究所)。空調房中風干(23℃)后, -20℃儲存備用。在養殖實驗結束時, 飼料中乳桿菌實測活菌數(成分分析保證值)為105CFU/g。詳細的飼料配方及其營養組成見表 1。實驗用羅伊氏乳桿菌菌株由廣東碧德生物科技有限公司提供。

1.2 實驗魚

實驗用黃顙魚購買自廣州魚豐水產養殖發展有限公司。幼魚入缸前用3% 的食鹽水(浸泡15min)進行體表消毒。暫養2周后, 禁食1d, 用MS-222(80 mg/L)輕微麻醉后, 選取健康、體格均勻的幼魚, 隨機分配到9個圓形玻璃纖維養殖缸中(直徑100 cm, 高75 cm; 缸內壁為銀灰色), 每組飼料設置3個平行養殖缸, 放養密度為35尾/缸, 實驗初始時魚體重為(14.23±0.65) g。

表 1 飼料配方及成分分析Tab. 1 Feed formulation and chemical composition

1.3 養殖管理與飼料投喂

養殖實驗在廣東省微生物研究所室內養殖實驗室進行, 采用靜水、非循環養殖系統, 養殖用水為曝氣后的自來水, 缸中有效水體約為缸體積的3/4。每隔3天進行1次換水, 換水量為養殖缸體積的1/3。整個實驗周期水溫的變化范圍為23—30℃,水體pH變化范圍為6.8—7.6, 溶氧＞ 6.0 mg/L。實驗采用人工光照(12h光照, 12h黑暗)。每組飼料投喂3個平行缸的實驗魚。實驗持續8周, 每天投喂2次(09:00和15:30), 日投喂量為每缸魚總重的3%。每次投喂前5min停水、停氣, 人工少量多次投喂, 以確保投到缸中飼料被完全攝食。投喂結束2h后用虹吸法對缸底進行吸污。每2周進行1次魚體稱重,調整日投喂量。稱重前1d禁食。

1.4 樣品采集與分析

養殖實驗正式開始時取3×6條與實驗魚規格接近魚樣, 過量麻醉致死后, -20℃密封保存, 用作初始魚體營養組成分析。實驗結束時, 禁食1d, 用MS-222對實驗魚進行輕微麻醉, 每缸魚批量稱重后, 取5尾魚測量體長和稱重, 尾靜脈抽血。采集的血液置于盛有冰塊的泡沫盒中, 待完全凝固后,4000×g離心10min(4℃)。制備得到的血清樣品于液氮中暫存, -80℃保存至分析。抽血后魚樣于冰盤上解剖后, 稱量其肝臟、空腔重量。另取5條魚去除胃中內容物后用作魚體營養組成分析。

魚體營養組成分析方法同飼料營養組成分析,按照GB/T-5009系列方法進行測定。魚粉及飼料中組胺含量采用分光光度法測定(GB/T 5009.45-2003/4.4)。血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、肝臟谷胱甘肽S轉移酶(GSH-ST)活力及肝臟丙二醛(MDA)含量等生化指標, 購買南京建成生物工程研究所試劑盒, 使用Thermo全波長酶標儀測定。采集的肝臟、腸道(腸道分段參見宋霖[15])及胃組織樣品, 置于波恩氏液中, 4℃固定12—24h。樣品經酒精梯度脫水及石蠟包埋后切片, 切片厚度為4 μm。切片經二甲苯脫蠟、蘇木精-伊紅染色及中性樹膠封片后, 光學顯微鏡下(型號: OLYMPS CX31) 觀察, 采集圖像。

1.5 數據計算與統計分析

實驗結束時魚體增重(Weight gain,WG)、特定生長率(Specific growth rate,SGR)、飼料系數(Feed conversion ratio,FCR)、肝體比(Hepotasomatic index,HSI)、肥滿度(Condition Factor,CF)和蛋白質效率(Protein efficiency ratio,PER)的計算公式分別為:

WG(%)=100×(FBW-IBW)/IBW

SGR(%/d)=100×[ln(FBW)-ln(IBW)]/t

FCR=FI/(FBW-IBW)

HSI(%)=100×WL/FBW

CF(100 g/cm3)=100×FBW/L3

PER(%)=100×(FBW-IBW)/(FI×FCP)

其中,FBW為實驗結束時每尾魚的平均重量(g);IBW為實驗初始時每尾魚的平均重量(g);FI為實驗期間每尾魚的攝食量(g);t為實驗天數;L為實驗魚的體長(cm);WL為對應實驗魚肝臟重量(g),FCP為飼料中蛋白質的百分含量(%)。

測得實驗數據用平均值±標準差(Mean±SD,n=3)表示。使用Origin 8.0進行單因素方差分析(One-way ANOVA)后, 采用Tukey對不同處理組組間差異進行多重比較分析, 且在P＜0.05時認為差異顯著。

2 結果

2.1 組胺及羅伊氏乳桿菌對黃顙魚生長性能和形態指標的影響

表 2顯示不同飼料處理組黃顙魚幼魚WG、SGR、FCR和PER無顯著差異(P＞0.05), 各組增重率為157%—163%, 蛋白質效率為2.1%—2.4%。各實驗組黃顙魚的HSI和CF差異不顯著(P＞0.05)。

2.2 組胺及羅伊氏乳桿菌對黃顙魚體組成的影響

各組實驗魚魚體水分、粗蛋白、脂肪和灰分含量無顯著差異(表 3)(P＞0.05)。在實驗結束時, 魚體粗蛋白含量為140—143 g/(kg濕重), 脂肪含量為85—89 g/(kg濕重)。

表 2 組胺及羅伊氏乳桿菌對黃顙魚生長性能及形態指標的影響Tab. 2 Effects of histamine and L. reuteri on growth performance and morphology indexes of P. fulvidraco

表 3 組胺及羅伊氏乳桿菌對黃顙魚魚體營養組成的影響Tab. 3 The effect of histamine and L. reuteri on body composition of P. fulvidraco (g/kg)

2.3 組胺及羅伊氏乳桿菌對黃顙魚肝臟健康狀態的影響

組胺及羅伊氏乳桿菌對黃顙魚血清谷丙轉氨酶(ALT)及谷草轉氨酶(AST)活力的影響見圖 1。結果顯示, H組血清ALT活力值為20 U/L, 顯著高于C組血清ALT活力(5 U/L)(P＜0.05)。H+B組ALT活力(7 U/L)與C組無顯著差異(P＞0.05), 但顯著低于H組(P＜0.05)。各飼料處理組黃顙魚血清AST與ALT變化趨勢相同, 即H組血清AST活力(756 U/L)顯著高于C組(241 U/L)(P＜0.05), H+B組AST活力(253 U/L)與C組無顯著差異(P＞0.05), 但顯著低于H組(P＜0.05)。

組胺及羅伊氏乳桿菌對黃顙魚肝臟谷胱甘肽S轉移酶(GSH-ST)活力及丙二醛(MDA)含量的影響見圖 2。結果顯示, H組肝臟GSH-ST活力值37.49 U/mg prot, 顯著高于C組肝臟GSH-ST活力(23.70 U/mg prot)(P＜0.05)。H+B組GSH-ST活力(25.48 U/mg prot)與C組無顯著差異(P＞0.05), 但顯著低于H組(P＜0.05)。H組肝臟MDA含量(1.95 nmol/mg prot)顯著高于C組(1.35 nmol/mg prot)(P＜0.05), H+B組MDA含量(1.45 nmol/mg prot)與C組無顯著差異(P＞0.05), 但顯著低于H組(P＜0.05)。

圖 1 血清谷丙轉氨酶及谷草轉氨酶活力Fig. 1 The activity of plasma ALT and AST

圖 2 肝臟谷胱甘肽S轉移酶活力及丙二醛含量Fig. 2 The activity of liver GSH-ST and the content of liver MDA

圖 3為HE染色后黃顙魚肝臟組織的顯微結構。結果顯示, C組肝臟細胞輪廓清晰, 細胞核(細實線箭頭)清晰可見; H組肝臟中有較多炎癥細胞浸潤(紅色箭頭)和少量肝細胞壞死(藍色箭頭); H+B組肝臟組織細胞結構完整, 無明顯異狀。

2.4 組胺及羅伊氏乳桿菌對黃顙魚腸道健康的影響

圖 4為HE染色后黃顙魚腸道組織的顯微結構。觀察顯示, C組中腸腸道皺襞排列緊密(圖 4C-1),細胞組織結構正常, 上皮細胞排列整齊, 微絨毛層相對齊整, 杯狀細胞大小相對均一(圖 4C-2); H組中腸腸道皺襞數目較對照組顯著減少, 皺襞長度明顯變短(圖 4H-1), 水腫嚴重, 但腸皺襞尚未形成脫落(圖 4H-2, 黑色箭頭); H+B組腸道皺襞數目及皺襞長度有明顯恢復(圖 4H+B-1), 且無明顯水腫現象發生(圖 4H+B-2)。

2.5 組胺及羅伊氏乳桿菌對黃顙魚胃健康的影響

圖 3 肝臟組織的顯微結構Fig. 3 Microstructure of liver

圖 4 中腸組織顯微結構Fig. 4 Microstructure of mid-intestine

圖 5 胃組織顯微結構Fig. 5 Microstructure of stomach

圖 5為HE染色后黃顙魚胃組織橫切后的顯微結構, 由漿膜、肌層、黏膜下層及黏膜層組成。不同于腸道, 胃黏膜皺襞頂端較為平緩, 且黏膜層中無杯狀細胞分布。結果顯示, H組和H+B組胃組織結構較C組, 皺襞形態、數量及長度無明顯差異(圖5C-1、H-1和H+B-1); 胃皺襞上皮細胞排列緊密, 胃腺腺泡輪廓清晰, 可見細胞核散布其中(圖 5C-2、H-2和H+B-2), 無明顯病理損傷。

3 討論

3.1 中等濃度組胺對黃顙魚生長性能及肝腸健康的影響

組胺作為生理毒性最強的一種生物胺, 是組氨酸在微生物作用下脫羧產生的一種毒素, 其含量高低是評價魚粉新鮮度的指標之一, 也是魚粉質量等級評定的重要參照標準[16]。目前業內研究工作者多采用在配方中添加腐敗魚粉或外源組胺2種方式,研究組胺對水產動物生長及健康狀況的影響。然而, 腐敗魚粉組分復雜, 除組胺外, 還含有毒素和尸胺、酪胺等生物胺。以腐敗魚粉為蛋白源時, 魚粉中毒素對養殖動物的影響[9]及其他物質對組胺的作用(如魚粉中的組胺增強子)[17—20], 使得難以準確判斷組胺對養殖動物的影響。因此, 本實驗采用添加外源組胺的方式研究組胺對黃顙魚的影響。實驗以優質白魚粉為主要蛋白源, 在配方中添加一定量的外源組胺, 模擬中等魚粉的組胺含量, 研究發現:飼料中組胺含量接近500 mg/kg時, 對黃顙魚的生長性能(WG、SGR、FCR和PER)無影響, 相似的結果在虹鱒[6](組胺添加量2000 mg/kg)中也有報道。然而, 組胺卻引起了羅非魚[4]、大西洋庸鰈[5]生長性能的下降。董小林[21]研究發現, 飼料中添加1000 mg/kg晶體組胺對長吻鮠的攝食(FI)和生長(SGR)有促進作用, 而更高含量的組胺(6000 mg/kg)則對生長性能無促進作用。組胺對不同養殖魚類生長性能的影響存有差異, 一方面可能是不同養殖魚類對組胺的耐受性和敏感性不同, 另一方面可能是養殖環境的差異或組胺添加量的不同使得組胺在機體中發揮的生理功能不同。在實驗條件下, 組胺對黃顙魚生長及飼料利用無影響, 是由于組胺含量較低未引起生長性能的變化還是組胺對黃顙魚生長無調控效果仍需進一步研究探討。

組胺是機體內普遍存在的一種炎癥因子, 其對水產動物組織器官的健康有一定的影響。Fairgrieve等[6]用組胺含量為2000 mg/kg的飼料飼養虹鱒,發現組胺會導致虹鱒胃部腫脹和黏膜層變薄。Opstvedt等[9]研究發現, 飼料中高濃度組胺會引起大西洋鮭胃腸道皺襞長度降低, 黏膜出現損傷; 在本研究中, 組胺未引起黃顙魚胃組織顯微結構的顯著變化, 但腸道皺襞數目明顯減少, 長度顯著變短, 相似的結論Li等[11]也有報道。谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)是與體內三大營養(蛋白質、脂質和糖類)物質及氨基酸代謝過程最緊密相關的兩種酶。兩種轉氨酶主要存在于肝臟中, 其活力高低是魚體內蛋白質合成和分解代謝強弱的重要體現。在正常的生理狀況下, 肝臟中ALT和AST活力極低,只有在肝功能發生障礙或肝細胞受損時, ALT和AST才會被釋放到血液中, 并表現出較高的活力,因此, 常常通過測定血液中ALT和AST的活力變化來檢測魚體肝臟的受損傷情況。實驗中測的對照組和乳桿菌添加組黃顙魚血清ALT活力分別為5和7 U/L, AST活力分別為241和253 U/L, 數值上和朱磊[22]、吳代武等[23,24]報道的黃顙魚血清ALT和AST活力值接近, 低于Elmada等[25]報道的血清ALT、AST活力(分別為11和328 U/L), 出現這種差異可能與實驗用飼料配方及養殖環境的不同相關。谷胱甘肽過氧化物(GSH-ST)是一種具有多種生理功能的二聚體蛋白, 可促使體內谷胱甘肽與有害物質相結合或以非酶結合方式將毒性物質排出體外, 以達到解毒的目的[26]。在本研究中, H組肝臟GSH-ST活力顯著高于C組, 這一變化趨勢與血清ALT和AST活力變化趨勢吻合, 表明中等濃度組胺對黃顙魚肝臟有一定的損傷。然而組胺引起肝臟損傷的機制仍需進一步研究。

3.2 羅伊氏乳桿菌對黃顙魚生長性能及肝腸健康的影響

羅伊氏乳桿菌是已報道的幾乎存在于所有脊椎動物和哺乳動物腸道內的乳桿菌, 是具有益生功效的腸道益生菌[27]。已有研究報道, 其可顯著改善陸生養殖動物的生長性能、免疫能力及腸道屏障功能。在飼料中添加0.75%的羅伊氏乳桿菌可使仔豬平均日增重率提高20.07%, 并顯著降低肝臟白球比和干擾素γ含量, 提升機體免疫能力[12]。給1日齡仔豬灌服羅伊氏乳桿菌, 可有效促進仔豬腸絨毛發育, 提高空腸二糖酶活力, 增強仔豬腸上皮細胞緊密連接蛋白表達, 改善腸黏膜屏障功能[13]。然而,羅伊氏乳桿菌對養殖魚類的影響, 目前僅在羅非魚中有見報道。Standen[28]研究發現在飼料中添加羅伊氏乳桿菌對羅非魚生長表現(WG和SGR)、飼料利用率(FCR和PER)和魚體營養組成無顯著影響,但對其免疫能力(紅細胞平均容量)有顯著調節作用。在本實驗中, 羅伊氏乳桿菌對黃顙魚的生長性能及魚體營養組成無影響, 可能與飼料中羅伊氏乳桿菌活菌數(105CFU/g)相對較低、養殖周期相對較短及養殖對象存有差異等因素有關, 但實驗條件下羅伊氏乳桿菌會顯著改善腸道組織的健康狀況,使腸道皺襞數目、長度恢復到正常水平及減少皺襞脫落。羅伊氏乳桿菌可以顯著改善宿主腸道健康的原因可能為: (1)代謝產生抗菌肽、黏膜免疫球蛋白等, 提高腸道免疫力[29]; (2)促進上皮細胞緊密連接蛋白表達, 改善黏膜屏障功能[13]; (3)調節細胞因子, 減少機體炎癥反應[30]; (4)和致病菌競爭營養物質、能量, 促進腸上皮細胞分泌MUC2和MUC3黏蛋白, 從而抑制致病微生物在腸黏膜上的黏附[31]。

在本實驗中, H+B組黃顙魚血清ALT、AST和肝臟GSH-ST活力及MDA含量顯著降低, 表明羅伊氏乳桿菌的添加可以顯著減輕肝臟炎癥反應。腸道不只是魚體的消化器官, 也是魚體最重要的免疫器官, 其與肝臟的相互作用是預防系統性炎癥和保護肝臟健康的重要途徑。羅伊氏乳桿菌可以顯著改善肝臟健康狀態可能與其維持腸道形態完整及改善腸道屏蔽功能及免疫能力有關, 相似的結論Hsu等[32]也有報道。另外, MDA含量的高低可以反映機體內脂質過氧化的程度和細胞的損傷程度, 實驗中H+B組黃顙魚肝臟組織MDA含量顯著低于H組, 表明乳桿菌的添加減輕了肝臟的氧化損傷, 而乳桿菌具有一定的抗氧化能力也早有報道[33,34]。羅伊氏乳桿菌是通過維持黃顙魚腸道形態完整、功能健全, 抑或是通過其自身或代謝產物的抗氧化能力來維持黃顙魚肝臟健康, 有待進一步研究。

4 小結

基于本實驗結果, H組(500 mg/kg)黃顙魚血清ALT、AST、肝臟GSH-ST活力及肝臟MDA含量顯著上升, H+B組血清ALT、AST、肝臟GSH-ST活力及肝臟MDA含量顯著低于H組, 而和C組無明顯差異; 組織顯微觀察, 發現H組肝臟有較多炎癥細胞浸潤及出現肝細胞壞死, 而H+B組肝臟細胞無明顯損傷; 腸道皺襞數目減少、長度變短, 有嚴重水腫,而羅伊氏乳桿菌添加組腸道皺襞數目及長度均可恢復到正常水平。這表明在實驗條件下, 中等濃度組胺使黃顙魚肝臟、腸道出現了明顯病理損傷, 而羅伊氏乳桿菌對組胺引起的肝腸損傷有一定的保護作用。