日光照周期對大菱鲆幼魚攝食、消化酶活力與血清激素含量的影響

李寶山 孫永智 王世信 黃炳山 王際英

(山東省海洋資源與環(huán)境研究院, 山東省海洋生態(tài)修復重點實驗室, 煙臺 264006)

光照是水生動物生長過程中重要的生態(tài)因子,直接或間接影響其生長、攝食、存活及繁殖內分泌, 并通過影響“下丘腦-垂體-性腺”軸(HPGaxis),影響血液中激素含量[1]。光照對水生動物生理的影響主要分為2種: 光照強度和光照周期。研究表明:光照強度對烏鱧(Channa Argus)[2]、褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)[3]等生長、繁殖均有顯著影響; 光照周期影響了虹鱒(Oncorhynchus mykiss)幼魚免疫系統(tǒng)發(fā)育[4], 黃花魚(Miichthys miiuy)消化酶活力[5],歐鱸(Perca fluviatilis)繁殖性能[6], 大菱鲆(Scophthatmus maximus)[7]、條石鯛(Oplegnathus fasciatus)[8]、大西洋鱈魚(Gadus morhua)[9]等魚類的生長性能。光照周期對水生動物生理生化的影響主要分為2種: 長光照周期和短光照周期。前者的相關研究主要集中在光周期的改變對生長、存活、免疫等方面的影響[4,10]; 后者主要集中于光周期改變對激素等的影響, 如光照周期顯著影響了大西洋鮭(Salmo salar)生長激素的分泌[11], 顯著改變了白斑狗魚(Esox lucius)耗氧率的晝夜節(jié)律[12]。

激素(Hormone)是由高度分化的內分泌細胞合成并直接分泌入血的化學信息物質, 它通過調節(jié)各種組織細胞的代謝活動來影響動物的生理活動, 對機體的代謝、生長、發(fā)育、繁殖和性別等起重要的調節(jié)作用。激素不參加具體的代謝過程, 只對特定的代謝和生理過程起調節(jié)作用, 調節(jié)代謝及生理過程的進行速度和方向, 從而使機體的活動更適應于內外環(huán)境的變化。Bj?rn等[11]報道了大西洋鮭生長激素(GH)水平受光照周期影響顯著; 田娟等[13]也報道了饑餓和再投喂顯著影響了尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)血清中GH和類胰島素生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)的含量, 并影響了其肝胰臟mRNA的表達豐度。這些研究報道均表明, 機體激素的分泌受生長環(huán)境的影響。

大菱鲆Scophthalmus maximusL., 又名多寶魚,是我國北方海水工廠化養(yǎng)殖的主要品種之一。在工廠化養(yǎng)殖條件下, 多以白熾燈為光源, 強度與周期均為人為控制。大菱鲆養(yǎng)殖過程中對光照強度的要求并不嚴格, 水面光照強度500—6000 lx均可[14], 光照節(jié)律多采用自然光周期, 而在其仔稚魚上的研究表明適當延長光照時間可促進生長[15]。因此本實驗在適宜的光照強度下, 測定了4種光照周期對大菱鲆幼魚攝食、前腸消化酶活力及血清激素含量的變化, 以期為其科學養(yǎng)殖策略的建立提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗設計與采樣

實驗分為4個處理, 分別為24L(光照)∶0D(黑暗,D1)、16L∶8D(D2)、8L∶16D(D3)、0L∶24D(D4), 每個處理3個重復, 每個重復放養(yǎng)體重(30.5±2.0) g的大菱鲆幼魚50尾。實驗在本研究院循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行, 養(yǎng)殖容器為Ф80 cm×H70 cm的綠色PVC水桶, 控制水深為45 cm, 每個水桶上方加蓋一個黑色蓋子, 每個蓋子中間安裝一個7 W的三基色節(jié)能燈為光源, 采用自動計時器控制光照周期, 水面光照強度約為1000—1500 lx。在實驗開始前, 實驗魚在養(yǎng)殖系統(tǒng)中馴養(yǎng)15d, 這期間采用9L∶15D(7:30am—4:30pm)光照周期, 日投喂2次(8:00am,4:00pm)商品飼料(CP≥50%, CL≥10%)。實驗持續(xù)7d, 期間每隔4h飽食投喂1次, 記錄投喂量, 投喂后30min, 排出殘餌數(shù)顆粒計算重量。實驗第7天時,每次投喂后取樣1次, 每次取3尾魚, 尾靜脈抽血分離血清后, 解剖取前腸, -80℃保存, 共計取樣6次(8:00am至次日4:00am)。

1.2 樣品測定與指標計算

腸道蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶活力采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定, 蛋白酶測定采用福林-酚法, 淀粉酶測定采用碘-淀粉比色法, 脂肪酶測定采用滴定法。蛋白酶活力單位(U)定義為在pH 8.0, 37℃條件下, 每毫克蛋白質中含有的蛋白酶每分鐘使吸光度變化0.003即為一個酶活力單位。淀粉酶活力單位(U)定義為每毫克蛋白質在37℃與底物作用30min, 水解10 mg淀粉定義為1個淀粉酶活力單位。脂肪酶活力單位(U)定義為在37℃條件下,每克蛋白質在本反應體系中與底物反應1min, 每消耗1 μmol底物為1個酶活力單位; 勻漿液中蛋白質含量采用考馬斯亮藍法測定。

血清中生長激素(GH)、皮質醇(COR)、去甲腎上腺素(NE)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)含量采用上海酶聯(lián)生物科技有限公司酶聯(lián)免疫(Elisa)試劑盒測定, 具體操作方法見說明書。

攝食率(Feeding rate, %)=日攝食量/體重×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007以及SPSS11.0 One-way ANOVA分析, 結果以平均值±標準差表示, 差異顯著時(P＜0.05), 用Duncan氏多重比較進行。采用SPSS11.0 Two-way ANOVA分析不同光照周期條件下, 不同采樣時間時攝食量、消化酶活力及血清激素含量的差異。采用origin8.1繪制血清激素含量變化圖。

2 結果

2.1 光照周期對大菱鲆幼魚攝食量的影響

在本實驗中, D2及D3組在整個實驗過程中攝食較為正常, 而D1及D4組第2天開始表現(xiàn)為易驚,攝食量下降, 第4天時有所好轉, 第6天攝食較為穩(wěn)定。

由表 1可見, 在不同光照周期條件下, 不同采樣時間時大菱鲆的攝食量均有差異。在24 L光照下,大菱鲆幼魚每隔8h出現(xiàn)一次攝食高峰, 在16 L及8 L光照下, 實驗魚分別在8:00am及4:00pm出現(xiàn)攝食高峰, 在0 光照下, 實驗魚的攝食量一直呈下降趨勢。各實驗組的攝食率均隨光照時間的縮短而降低(P＜0.05), D1組日攝食量比其他三組分別提高了5.59%、13.31%和71.87%。

2.2 光照周期對大菱鲆幼魚消化酶活力的影響

不同光照周期和采樣時間時實驗魚消化酶活力均存在差異(表 2、表 3和表 4)。D1、D2和D3組蛋白酶及淀粉酶活力在12:00am和8:00pm出現(xiàn)2個峰值, 且8:00pm時的峰值高于12:00am。D4組酶活呈先降后升趨勢, 但一直維持在較低水平。D1、D2和D3組12:00am至8:00pm脂肪酶活力顯著高于D4組, 其余時間酶活力無顯著差異, 且0:00am后各組脂肪酶活力變化不顯著。

2.3 光照周期對大菱鲆幼魚血清激素含量的影響

由表 5可見, 光照周期及采樣時間時大菱鲆幼魚血清中GH、COR、NE及T3的含量均存在顯著差異。

實驗期間, 各組實驗魚血清生長激素(GH)含量均呈先降后升再降低的趨勢, 表現(xiàn)出較強的時間節(jié)律性(圖 1a)。各組8:00am至8:00pmGH含量無顯著變化, D4組0:00am和4:00am時GH含量顯著低于其他三組(P＜0.05), D1組4:00am時GH含量顯著高于其他三組(P＜0.05)。

表 1 光照周期對大菱鲆幼魚攝食量的影響Tab. 1 The effect of photoperiod on feed consumption of juvenile turbot Scophthalmus maximus L. (g)

表 2 光照周期對大菱鲆幼魚蛋白酶活力的影響Tab. 2 The effect of photoperiod on protease of juvenile turbot Scophthalmus maximus L. [U/(mg.prot)]

表 3 光照周期對大菱鲆幼魚淀粉酶活力的影響Tab. 3 The effect of photoperiod on amylase of juvenile turbot Scophthalmus maximus L. [U/(mg.prot)]

由圖 1b可見, D1、D2、D3組初次攝食8h內皮質醇(COR)含量變化不顯著, 8:00pm時驟然升高,之后逐漸降低; D4組4:00pm時含量顯著高于其他組(P＜0.05); D1、D2組8:00pm及0:00am時顯著高于D3、D4組(P＜0.05); 4:00am時各組之間差異不顯著(P＞0.05)。

由圖 1c可見, 光照周期顯著影響了大菱鲆幼魚去甲腎上腺素(NE)的含量。8:00am至4:00pm各組NE含量無顯著差異(P＞0.05); D4組實驗魚8:00pm時顯著高于其他組(P＜0.05); D1、D2組0:00am時顯著高于其他組(P＜0.05); 4:00am時各組無顯著差異(P＞0.05)。

D2組8:00am及12:00am時三碘甲狀原氨酸(T3)含量顯著高于其他組(P＜0.05), D4組8:00pm時三碘甲狀原氨酸(T3)含量顯著低于其他組, 0:00am顯著高于其他組(P＜0.05), D2、D3組4:00am顯著低于D1、D4組(P＜0.05); 各組T3最高值均出現(xiàn)在8:00pm (圖 1d)。

3 討論

3.1 不同光照周期對大菱鲆幼魚攝食的影響

光照周期對魚類的影響可分為短期影響及長期影響, 魚類攝食節(jié)律的研究方法有分段式投喂法和一次性飽食投喂法。本實驗采用短期分段式投喂研究光照周期對大菱鲆攝食的影響。在本研究中, 不同光照周期條件下, 各組大菱鲆幼魚均在8:00am出現(xiàn)一個攝食高峰, D1到D3組在4:00pm時出現(xiàn)另一個攝食高峰, 這與鄭珂珂等[16]的研究較為一致, 而D4組攝食量呈一直下降的趨勢, 且由于本實驗中光照強度較弱, 因此可認為大菱鲆幼魚屬于典型的晨昏攝食類型。在本實驗中, 隨著光照時間的延長, 實驗魚的日攝食量及攝食率均呈上升趨勢,這與在羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergh)及斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)幼體的研究結果一致[17,18], 光照影響魚類攝食的原因主要有: ①光照能促進魚類的活動, 從而提高其覓食能力; ②光照可能促進生長激素的分泌, 從而提高大西洋鮭的食欲[19]。Biswas等[20]研究, 真鯛(Pagrus major)的生長及飼料利用隨著光照時間的延長而增加, 但在大菱鲆[7]及南極石首魚(Argyrosomus japonicu)[21]上的研究表明, 長期光照對魚類的生長及飼料利用的影響是負面的, 但階段性的提高光照周期可以促進魚類的生長及飼料利用。在本實驗中, 實驗魚對光照周期改變的適應能力較強, 且光照會增加實驗魚的攝食量, 但這種影響能持續(xù)多長時間需進一步的研究。此外, 實驗魚前期養(yǎng)殖中所采用的管理策略對其攝食生理造成的影響也需要進一步的研究。

表 5 光照周期及采樣時間對大菱鲆血清激素含量的主效應分析Tab. 5 Main effect analysis of photoperiod and sampling time on serum hormone content in turbot Scophthalmus maximus L.

研究表明自然界中許多魚類的攝食存在晝夜節(jié)律[22], 且不同的光照周期及投喂間隔會影響某些魚類的攝食量、生長及飼料利用[23]。因此, 本實驗模擬自然光節(jié)律, 以24h為一個光照周期, 并采用4h投喂間隔研究光照周期對大菱鲆攝食量的影響。在本實驗中, D1—D3組日攝食率顯著高于本實驗室其他在相同規(guī)格大菱鲆上的研究[24,25], 表明適當加大投喂頻率會促進大菱鲆的攝食。但魚類攝食量的增加會對機體造成的一系列生理生化影響, 這種攝食量的增加是否能長期維持下去, 有待于進一步研究。

3.2 不同光照周期對大菱鲆幼魚前腸消化酶活力的影響

本實驗中測定的3種消化酶均為胰酶[26], 胰酶的分泌受神經和體液的雙重調控[27], 并受外部環(huán)境的影響[26,28—30]。在人類上的研究表明, 食物的視覺和味覺可以通過迷走神經調控消化酶分泌, 在魚類上尚未見相關報道[31]。消化酶的體液調控主要是通過胃腸激素激素完成的, 而食物是引起胃腸激素分泌的自然刺激物。與本實驗室其他在大菱鲆上的研究相比, 本實驗所測得的3種消化酶活力均相對較高。一方面本實驗是投喂之后取樣, 且取樣間隔時間較短, 其他研究多在禁食24h后取樣, 由此導致了測定的消化酶活力有較大變化; 另一方面可能由于光照周期影響了機體內的激素分泌[32], 從而對其生理節(jié)律造成了影響, 這在斜帶石斑魚上也有類似的報道[18]。

由于本實驗持續(xù)時間較短, 缺乏飼料利用、生長等數(shù)據(jù), 所以不能得出該規(guī)格大菱鲆適宜的最適宜的光照周期及投喂頻率。但從實驗魚的攝食及消化酶活力的變化規(guī)律分析, 12—16h光照、日早晚投喂2次更符合大菱鲆的生理節(jié)律。

圖 1 不同光照周期對大菱鲆血清激素含量的影響Fig. 1 The effect of different photoperiod on serum hormone contents of turbot Scophthatmus maximus L.

3.3 不同光照周期對大菱鲆幼魚血清激素含量的影響

脅迫(Stress)是魚類應對環(huán)境改變的一種保護機制。環(huán)境脅迫與魚體神經內分泌系統(tǒng)有著廣泛聯(lián)系, 魚體對環(huán)境脅迫產生的應激反應最終結果是導致其血液激素水平升高[33]。已有研究表明, 血清內許多激素的變化是脈沖式[34,35], 單個時間取樣所測的激素水平的平均值難以反映其真實情況。草魚在正常投喂條件下, 4h左右出現(xiàn)一次生長激素高峰[35], 因此本實驗采用了4h的取樣時間。

生長激素(Growth hormone, GH)是腺垂體細胞分泌的一種肽類激素。在正常情況下生長激素呈脈沖式分泌, 受下丘腦產生的生長激素釋放素(GHRH)和生長激素抑制激素(GHIH)的調節(jié), 還受性別、年齡和晝夜節(jié)律的影響[36]。生長激素的主要生理功能是促進神經組織以外的所有其他組織生長, 促進機體合成代謝和蛋白質合成, 促進脂肪分解, 抑制葡萄糖利用而使血糖升高等作用。在本實驗中, 大菱鲆血清GH含量變化呈現(xiàn)出明顯的脈沖性, 且GH含量與曾霖等[37]報道較為一致。此外,長期黑暗導致了D4組實驗魚血清GH含量下降, 如果此種情況得以延續(xù), 必然會導致其生長性能下降。在本實驗中大菱鲆血清GH峰值出現(xiàn)的時間與其他動物差異較大[32], 這可能與實驗環(huán)境, 尤其是光照強度有關。

皮質醇(Cortisol, COR)是從腎上腺皮質中提取出的對糖類代謝具有最強作用的腎上腺皮質激素,是“抗應激激素”, 也是水生動物中研究最為廣泛的激素[38,39]。在本實驗中, 長時間光照(D1、D2組)提高了血清COR含量, 這與大菱鲆對溫度和鹽度的反應較為一致[37,40], 表明短期光照周期的改變對大菱鲆是一種脅迫環(huán)境。皮質醇具有晝夜和季節(jié)變化節(jié)律, 并受光周期、光強度和溫度等環(huán)境因素的影響, 長期光照對皮質醇影響不顯著[20], 這表明了動物對環(huán)境脅迫的一種適應性。相較于黑暗(D4組),光照(D1、D2組)對大菱鲆血清皮質醇的影響更為顯著, 說明長期光照是比黑暗更為強烈的環(huán)境脅迫。

去甲腎上腺素(Noradrenaline, NE)是腎上腺素去掉N-甲基后形成的物質, 在化學結構上屬于兒茶酚胺, 它既是一種神經遞質, 也是一種激素。它可以通過α受體激動, 引起血管極度收縮, 使血壓升高, 冠狀動脈血流增加。在本實驗中, 光照僅在8:00pm和0:00am時對NE含量有影響, 但并為改變其總體趨勢。目前關于水生動物去甲腎上腺素的研究較少, 光照改變NE含量的原因尚需進一步研究, 但也有可能是由于實驗操作或實驗誤差導致的。

三碘甲狀腺原氨酸(Triiodothyronine)是由甲狀腺分泌出的活性物質, 它對蛋白質合成、體溫調節(jié)、能量產生和調節(jié)有著極為重要的作用[41]。在異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)上的研究表明,免疫增強劑能提高血清T3、降低COR水平[42]。在本實驗中未發(fā)現(xiàn)此種現(xiàn)象, T3含量表現(xiàn)出較強的規(guī)律性, 延長光照時間或長期黑暗對其含量有一定影響, 這可能是機體應對急性脅迫的一種對策[43]。

在本研究中, 由于采用了短期光照周期, 大菱鲆幼魚攝食、消化酶活力及血清激素含量仍表現(xiàn)出較強的時間節(jié)律性, 長期光照周期對血清激素時間節(jié)律的影響仍需進一步研究。Imsland等[7]發(fā)現(xiàn)長期光照周期(46個月)下, 長期連續(xù)光照降低了大菱鲆的生長, 降低了血清11-甲基睪酮的含量。因此, 在養(yǎng)殖生長中推薦以8—16h光照周期為宜。

4 結論

在本實驗中, 不同的光照周期顯著影響了大菱鲆幼魚的攝食、消化酶活力及血清激素水平。在此光照強度下, 大菱鲆養(yǎng)殖采取8—16h 光照周期、日投喂2次為宜。