飼料β-葡聚糖和滅活乳酸菌的添加對泥鰍幼魚生長性能、腸脂肪酸組成及免疫性能的影響

陳靖雯 郭道遠 趙 冰 曹小娟 高 堅 ,

(1. 華中農業大學水產學院, 武漢 430070; 2. 武漢百科金典生物科技有限公司;3. 華中農業大學, 水產養殖國家級實驗教學示范中心, 武漢 430070)

泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)是我國重要的小型淡水經濟魚類。由于其肉質鮮滑, 營養豐富,具有較高的藥用價值, 素有“水中人參”的稱號, 深受消費者喜愛。近幾年, 泥鰍養殖業規模不斷發展,高密度集約化養殖程度不斷擴大, 養殖單位產量逐年提升。然而水產集約化養殖導致養殖環境的惡化, 各種應激脅迫因子增加, 魚體質變弱免疫力下降, 養殖過程中魚病頻發[1]。雖然抗生素在水產養殖疾病防治中有較好的應用效果, 但是抗生素對人和動物所產生的一系列負面影響也頻繁發生[2]。隨著人們生活水平的日益提高, 對水產品的質量安全意識不斷增強, 尋求其他安全有效的途徑來提高水產養殖業的可持續發展顯得刻不容緩。

近年來, 益生菌作為飼料添加劑可提高魚類免疫, 在水產養殖業得到廣泛的關注[3]。然而在飼料中活益生菌的添加可能會被引進到開放的水環境,引發人們對水產業新的擔憂。滅活菌不會影響其他水生生物生存環境, 因此被逐漸應用于水產養殖過程中替代活菌制劑[4]。乳酸菌不耐受高溫高壓環境, 但是熱滅活乳酸菌(HK-LP)能夠抵抗飼料制粒過程中的高溫高壓[5]。在過去的研究中發現, 加熱滅活的酪酸菌在鮸魚(Miichthys miiuy)身上有明顯的免疫調節性能[6]。加熱滅活的創傷弧菌疫苗比福爾馬林滅活的疫苗能更有效地引起牙鲆(Paralichthys olivaceus)的免疫應答[7]。滅活乳酸桿菌P-8對大菱鲆(Scophthatmus maximu)幼魚血清生化指標和抗氧化能力有顯著性影響[8]。

β-葡聚糖屬于非淀粉多糖, 存在于酵母細胞壁和真菌的菌絲體中, 是一種具有增強免疫力的多糖[9]。酵母來源的β-葡聚糖因其免疫促進作用而被廣泛應用于畜禽和水產動物飼料中。在魚類中, β-葡聚糖不僅能夠刺激巨噬細胞, 提高其殺滅病原菌的能力, 還可以提高魚類非特異性免疫機制的其他因子,如溶菌酶和補體系統[10]。目前有研究表明, 在飼料中添加β-葡聚糖可以提高凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)的增重率并有效地降低了飼料系數[11], 促進錦鯉(Cyprinus carpio)的生長性能[12], 提高南亞野鯪(Labeo rohita)的特定生長率[13], 提高海參(Apostihopus japonicus)抗燦爛弧菌(Vibrio splendidus)的能力[14]以及提高花鱸(Lateolabrax japonicus)增重率、免疫性能和抗氨氮應激能力[15]。

同時, 有研究表明BG和HK-LP具有一定的相互作用, Dawood等[16]發現BG和HK-LP的相互作用顯著影響了真鯛(Pagrus major)幼魚的表觀消化率及血液中相關的生理生化指標。關于飼料添加BG和HK-LP對泥鰍生長、免疫性能影響的研究還鮮有報道。因此, 本研究以泥鰍為實驗對象, 在飼料中添加不同水平BG和HK-LP, 研究對泥鰍幼魚生長性能、腸道脂肪酸組成, 免疫相關酶活性和基因表達的影響, 確定BG和HK-LP在泥鰍飼料中的最佳添加量, 為泥鰍專用飼料研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗設計及實驗飼料配制

泥鰍飼料配方設計參照Gao等[17]。以脫脂魚粉、大豆濃縮蛋白及酪蛋白為主要蛋白源; 阿爾法淀粉為糖源, 魚油、大豆油和大豆卵磷脂為脂肪源。實驗設計為雙因素實驗設計, 即在基礎飼料中分別添加0和0.1% β-葡聚糖, 在此基礎上再分別添加0.025%、0.05%和0.1%的滅活乳酸桿菌, 熱滅活植物乳酸桿菌購于Bioforte Biotechnology Corp (中國深圳)。微粒子飼料(0.1—0.3 mm)的制作方法參照Gao等[18]。制作后的飼料放入密封袋中, 于-20℃冰箱中保存待用。飼料營養成分見表 1。

1.2 實驗魚及投喂實驗

實驗用泥鰍幼魚在本實驗室繁殖獲得, 具體方法參照Gao等[18]。飼養實驗在華中農業大學水產學院養魚房的流水養殖系統中進行。在開始正式實驗前, 泥鰍幼魚暫養2周。實驗開始時, 實驗魚饑餓24h, 然后稱取魚體質量(平均初始體質量約為0.17 g),并挑選出規格一致的泥鰍進行分組實驗, 在18個流水養殖系統中進行, 養殖箱體積為50 L (80 cm×40 cm×50 cm), 水體積為40 L, 放養密度為50尾/箱,水流為1 L/min, 每種飼料隨機投喂3組實驗魚。每天飽食投喂3次(09:00、13:00和20:00)。養殖周期80d。每天記錄投飼量, 如有死魚記錄數量并稱重。實驗期間水體溫度在26—28℃, 溶氧保持＞5 mg/L。

1.3 樣品采集

在80d養殖實驗結束后, 禁食24h, 對每個水箱的魚進行稱重和計數, 用于計算增重率、特定生長率、存活率等指標。從每個水箱中隨機抽取10尾魚取體表黏液用于免疫活性檢測[19]; 另取10尾魚解剖取腸道, 用于脂肪酸組成分析; 再另取10尾魚解剖取內臟, 用作免疫相關基因表達水平的測定。免疫活性檢測的黏液樣品采集后立即開始, 用于腸道脂肪酸組成分析及基因表達分析樣品分別混合后凍存于-80℃。

1.4 營養組成分析

實驗飼料的常規營養分析參照AOAC[20]的方法進行: 水分含量測定采用105℃烘干法, 粗蛋白含量測定采用凱氏定氮法, 粗灰分含量測定用馬福爐550℃灼燒法。實驗飼料和全魚體的全脂肪含量分析參照Bligh和Dyer[21]的方法進行。

1.5 腸道脂肪酸組成分析

從實驗魚腸道提取的總脂肪經過皂化后, 采用氣相色譜(Agilent Technologies Inc., Santa Clara,California, USA; column: OmegawaxTM320)對樣品脂肪酸組成進行分析, 方法參照Li等[22]所述。

1.6 免疫相關酶活性檢測

按照南京建成生物工程研究所生產的試劑盒所示要求和操作, 進行體表黏液中蛋白濃度的測定并采用酶促反應速度的方法檢測溶菌酶(LZM)、酸性磷酸酶(ACP)及堿性磷酸酶(AKP)的活性。

1.7 熒光實時定量PCR檢測免疫相關基因表達

提取各實驗組泥鰍肝臟中RNA以液氮為介質,在研缽中將組織研磨成粉末狀, 按照RNAiso Plus說明書提取并純化總RNA。瓊脂糖凝膠電泳法檢測其完整性, 超微量分光光度計法檢測其濃度和純度。參照逆轉錄試劑盒(TaKaRa, China)說明進行反轉錄。實時定量檢測利用Mini Option實時定量PCR檢測系統 ( Bio-Rad, USA) 進行, 反應體系為10 μL∶0.4 μL 10 mmol /μL的上下游引物、1 μL逆轉錄產物、5 μL 2 ×SYBR Premix ExTaqTMⅡ S、3.2 μL滅菌水。根據本實驗泥鰍轉錄組數據獲得泥鰍Hsp70、Hsp90α和Tlr1基因序列, 用Primer premier 5 設計實時定量PCR特異引物(表 2)。反應條件為 95℃, 10s; 95℃, 15s; 60℃, 15s; 40個循環。根據擴增曲線得到的Ct值(熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數), 計算出目標基因和對照基因βactin和Gapdh Ct值的差異ΔCt; 以差異最大的樣本作為參照樣本, 計算出不同樣品相對于參照樣本的基因表達倍數2-ΔΔCt, 從而制作出相對定量的圖表。

表 1 實驗用飼料配方及營養組成Tab. 1 Formulation and proximate composition of the experimental diets (%)

表 2 熒光實時定量PCR引物Tab. 2 Nucleotide sequences of the primers for reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).

1.8 相關指標計算公式

數據采用SPSS19.0 統計軟件進行處理, 所有實驗組(2因素3水平, 2×3)進行雙因素方差分析(Twoway ANOVA)的基礎上, One-way ANOVA方差分析和Duncan' s均值多重比較法對試驗結果差異顯著性進行分析處理。P＜0.05, 認為差異顯著 。統計結果以平均值±標準差(Mean±SD)的形式表示。

2 結果

2.1 生長性能

通過雙因素方差分析, 飼料添加BG或HKLP分別顯著調高了泥鰍幼魚的最終均重, 增重率和特定生長率, 顯著減低了飼料系數(P＜0.05), 但是BG和HK-LP的相互作用對各實驗組泥鰍幼魚的終末體重、增重率、特定成長率和存活率皆無顯著性差異(表 3)。與BG0/HK-LP0.025組相比較,BG1/HK-LP0.1組的最終均重、增重率、特定生長率和飼料系數出現顯著差異(P＜0.05)。在BG同等添加情況下, HK-LP的添加量為0.1%時與添加量為0.025%和0.05%的兩個實驗組在最終均重、增重率及特定生長率表現出顯著上升(P＜0.05), 而在飼料系數顯示為無顯著差異。

2.2 泥鰍幼魚腸道脂肪酸組成分析

泥鰍腸道脂肪酸組成見表 4。結果顯示飼料中添加BG和HK-LP兩者之間的相互作用對泥鰍腸道內的脂肪酸組成無顯著性影響。但是添加1.0%BG飼料顯著降低了泥鰍腸道C16∶1n-7、C18∶2n-6以及總n-6系脂肪酸的比率。隨著HK-LP添加量的升高顯著降低了C22∶ 1n-11的比率(P＜0.05)。

2.3 泥鰍幼魚皮膚黏液中免疫相關酶表達情況分析

各組實驗泥鰍幼魚皮膚黏液中LZM、ACP、AKP三種免疫相關酶進行酶活性結果見圖 1。BG、HK-LP及兩因素的相互作用顯著影響了體表黏液中AKP活性(P＜0.05), 隨著HK-LP的添加濃度增加, AKP活性顯著增強。然而添加1%BG與不添加組相比, AKP活性出現顯著降低趨勢。而HKLP顯著影響了LZM活性(P＜0.05), 且LZM的活性隨HK-LP的濃度上升而增強。

2.4 泥鰍幼魚肝臟中免疫相關基因表達變化

添加BG及HK-LP顯著影響了泥鰍肝臟免疫相關基因的表達水平(圖 2)。當飼料中添加1%BG和0.05%HK-LP顯著上調了Hsp70及Hsp90α表達水平。雙因素方差分析表明: BG的添加顯著降低了Tlr1基因表達水平(P＜0.05)。

3 討論

在本研究中, 經過80d飼喂后, 飼料中添加了BG和HK-LP顯著降低了飼料系數, 提高了泥鰍幼魚的增重率、特定成長率及最終均重。這表明2種添加物質均能夠有效地改善泥鰍幼魚的生長性能。同樣結果也發現在其他魚種, 陳超然等[23]在異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)的研究中發現, 飼料中添加一定量的BG提高了其增重率。在遲淑艷等[24]的研究中也發現, 在奧尼羅非魚(Oreochromis aureus ♂ × O. niloticus♀)中添加1.0%—1.5%的BG能夠顯著改善其生長性能以及抗嗜水氣單胞菌侵染的免疫能力。HK-LP常作為飼料添加劑, 通過定殖于生物體胃腸道等部位后大量繁殖, 可抑制病原菌的生長, 產生維生素和促進生長因子等物質,增加機體對飼料的消化和吸收, 提高生長與成活[25]。斜帶石斑魚(Epinephelus coiodes)攝食添加一定量的植物乳酸桿菌的飼料4周后, 增重率顯著高于對照組[26]。

表 3 喂養實驗飼料80d后對各實驗組泥鰍幼魚生長性能的影響Tab. 3 Growth performance of juvenile loach fed with test diets for 80 days*

表 4 飼養實驗80d后泥鰍幼魚腸道脂肪酸組成Tab. 4 Fatty acid composition (% of total fatty acids) in intestine of loach after 80 days

圖 1 泥鰍體表黏液中酸性磷酸酶、堿性磷酸酶及血清溶菌的活性(U/mg prot), 數據為取樣測得的平均值Fig. 1 The activities of alkaline phosphatase (AKP), acid phosphatase (ACP), lysozyme (LZM) (U/mg protein) in skin mucus of loach

圖 2 肝臟中Hsp70, Tlr1和Hsp90α的表達情況Fig. 2 Relative mRNA expression levels of Hsp70, Tlr1 and Hsp90α gene in liver of loach

在我們之前的研究中發現, 飼料中添加適量BG改變了泥鰍腸道微生物菌群, 進而降低了泥鰍脂肪的沉積[27], 表明腸道菌群與魚體脂肪吸收和代謝密切相關。在本研究中發現, 飼料中添加BG顯著減低了泥鰍腸道C16∶1n-7及C18∶2n-6的比率, 這可能是因為添加BG改變了腸道微生物菌群, 而影響了腸道對飼料脂肪酸的吸收和轉運, 從而影響了腸道脂肪酸組成。

BG是一種不能被動物腸道自然消化的碳水化合物, 通常與益生菌一起使用, 通過調節腸道微生態和刺激免疫系統來促進生物長期健康生長。在Dawood等[16]對真鯛的研究中則發現, 飼料中添加HK-LP和BG的相互作用影響了真鯛非特異性免疫活性。本研究結果也發現了, 在不添加BG組隨著HK-LP添加量的增加, ACP呈現下降趨勢, 而在BG添加組隨著HK-LP添加量的增加, ACP呈現出升高的趨勢。這表明了飼料BG可影響HK-LP對泥鰍體表黏液中的ACP活性。LZM廣泛存在于魚類各種體液、血清和巨噬細胞中的一種水解酶, 是生物機體在免疫反應過程中分泌的具有溶解細菌作用的非特異性免疫因子。LZM活性是決定吞噬細胞能否殺滅所吞噬的致病菌的物質基礎之一[28]。在本研究中, 隨著BG和HK-LP添加量的增加,LZM活性出現上升, 且1%BG和0.1%HK-LP組顯著高于其他實驗組, 表明了飼料添加1%BG和0.1%HKLP對泥鰍非特異性免疫具有良好的添加效果。

熱應激蛋白(Heat shock protein, HSP)是細胞在應激刺激下生成的一組蛋白質, 對脅迫環境的應答等起到了重要作用[29]。Hsp70和Hsp90α是HSP家族的重要成員,Hsp70對于應激條件可產生耐受和保護作用, 具有高度保守和交叉耐受性[30], 而Hsp90α通過和抗原的結合, 參與免疫反應, 向免疫細胞提呈抗原肽[31]。在本研究中, 以β-actin和Gapdh作為雙內參基因檢測泥鰍肝臟組織中Hsp70,Hsp90α和T l r1的相對表達量。當飼料添加1%B G和0.05%HK-LP時, 泥鰍肝臟Hsp70和Hsp90α表達水平顯著高于其他實驗組, 表明了1%BG和0.05%HKLP的添加對泥鰍產生了應激反應, 激發了泥鰍肝臟中熱應激蛋白的保護作用。Toll樣受體(Tlr1)是胚系編碼的模式識別受體, 來識別病原相關分子模式。在本實驗中, 在無添加BG組, 隨著HK-LP添加量的增加, 上調了Tlr1表達水平, 這可能是因為添加HK-LP, 誘發了泥鰍對病原體的識別系統。而當飼料中添加1%BG時, 添加HK-LP沒有對Tlr1產生影響, 關于BG對Tlr1表達水平的影響還需進一步研究。

綜上所述, 本研究結果表明, 飼料添加BG和HK-LP可改善泥鰍幼魚的生長及免疫性能, 影響了腸道脂肪酸組成, 激發了泥鰍Hsp70、Hsp90α及Tlr1基因的表達水平。因此, 在泥鰍養殖過程中BG和HK-LP可作為有效的飼料免疫增強劑, 在泥鰍幼魚飼料中的最適添加量為: BG 1%和HK-LP 0.1%。