中華鱉Foxl2基因克隆及外源性激素對其表達的影響

高麗麗 刁曉明 李 云 翟旭亮 周春龍

(1. 西南大學動物科技學院, 重慶三峽生態漁業產業技術研究院, 重慶 400715; 2. 西南大學淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室, 重慶 400715; 3. 重慶市水產技術推廣站, 重慶 400020)

Foxl2(Forkhead transcriptionfactor gene 2)是叉頭狀轉錄因子超家族(Forkhead transcriptionfactor,FOX)成員之一[1,2], 1993年被發現, 主要在垂體和卵巢顆粒細胞中表達, 通過轉錄調節其目的靶基因的轉錄、蛋白表達, 參與顆粒細胞的增殖與分化, 與卵巢發育性二態分化和卵巢功能維持密切相關[2—4]。Foxl2突變引起小瞼裂綜合征(BPES)、卵巢早衰(POF)、腫瘤及山羊的無角間性綜合征(PIS)[4—6]。迄今Foxl2基因已在許多脊椎動物和部分無脊椎動物中獲得, 且結構高度保守。Foxl2在哺乳動物中研究最為深入, 被認為是雌性相關基因[4,6]。國外學者對許多龜鱉動物的Foxl2基因進行了較為詳細的研究[7,8], 但對于中華鱉Foxl2基因的相關研究未見文獻報道。

中華鱉(Pelodiscus sinensis)隸屬于爬行綱、龜鱉目、鱉科(Trionychidae)、鱉屬(Pelodiscus), 之前溫度依賴型性別決定模式已被公認, 但總有20%—30%的個體并沒有沿溫度方向發育, 遺傳因素是影響其性別發育方向的重要方面[9]。對于爬行動物, 關鍵基因除外, 性激素在一定程度調控性別分化[10,11], 且在不同的發育階段發揮不同的作用[12]。

本實驗室克隆了Foxl2 cDNA部分序列, 并以10 mg/kg劑量的MT和E2對中華鱉成鱉進行注射實驗, 通過分析Foxl2表達變化, 旨在生理水平顯示外源性激素處理后Foxl2的響應模式, 以分析激素與性別相關基因的關系, 為中華鱉性別調控機制提供一定的生物學資料。

1 材料與方法

1.1 材料

2015年5月22日, 從重慶市北碚區歇馬鎮星云養殖場購買150只中華鱉, 體長為(12.01±2.01) cm,體寬為(11.20±1.20) cm, 體重為(291.80±103.80) g,置于室內淡水循環養殖池中暫養3d, 水源為曝氣自來水, 水溫為(26±0.5)℃。共分為5個組。

1.2 試劑

17α-甲基睪酮(MT)和17β-雌二醇(E2)購自生工生物工程(上海)股份有限公司, Trizol試劑以及pMD18-T Vector購自Takara, IScriptTMcDNA Synthesis Kit以及SsoFast Eva Green購自Bio-Rad,GoTaq(R)Green MasterMix和BM5000 DNA Marker購自Promega, 其余國產分析純試劑, 購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 實驗設計

在本實驗開展的前期, 已經研究了中華鱉Foxl2多種組織的時空表達, 結果表現出典型的性別二態性, 卵巢表達量明顯高于精巢表達量(結果待發表),在此研究工作的基礎上, 以同一濃度激素分別注射雌性與雄性個體, 充分顯示E2和MT對中華鱉成鱉Foxl2基因表達的影響。

在馴養3d后, 剔除體弱或受傷個體, 測量體型參數, 注射激素后放入對應編號養殖池。1號池為對照組, 2、3、4、5號池為實驗組。劑量為10 mg/kg,每組設3個重復, 每個重復10只, 實驗周期15d。注射后的0、6h、12h、24h、48h、7d和14d時間點隨機抽取實驗個體, 以0為對照組, 并取出卵巢和精巢組織置于液氮中保存備用, 后轉入-80℃冰箱保存,以備總RNA提取。

1.4 總RNA提取與cDNA合成

上述采集到的組織樣品用研缽在液氮中充分研磨, 取100 mg左右的研磨干粉, 根據Trizol(TakaRa)一步法提取各組織樣品總RNA, 所得到的總RNA定量到1 μg。通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳, Goldview染色, 檢測RNA的完整性。將所有樣品的總RNA用微量核酸測定儀(NanoDrop 1000)測定其濃度和純度, 確保OD值在1.8—2.0。根據IScriptTMcDNA Synthesis Kit(Bio-Rad)試劑盒合成cDNA, 得到的cDNA -20℃保存備用。

1.5 基因克隆和序列分析

根據Ensembl網站預測的中華鱉Foxl2基因mRNA序列, 針對于Foxl2基因的保守區域, 利用Primer Premier 5.0軟件來設計兼并引物, 用于后續實驗過程中的同源克隆。設計好的引物序列由華大基因公司合成; 所涉及的引物如下:Foxl2 (F: 5′-ATGATGGCCAGCTACCAGG-3′, R: 5′-CTAGATG TCTATCCGGGAGTGC-3′); GAPDH (F: 5′-AGAA CATCATTCCAGCATCCA-3′, R: 5′-CTTCATCA CCTTCTTAATGTCGTC-3′, GenBank登錄號:AB 124567.1)。引物均稀釋為10 μmol/L備用。

以卵巢組織的總RNA進行反轉錄生成第一鏈cDNA, 并將該cDNA作為模板, 使用Foxl2的上、下游引物, 對該目的基因進行PCR擴增。PCR體系為25 μL, 擴增條件: 94℃ 5min; 35個循環(94℃ 40s,60℃ 40s); 72℃ 5min。PCR擴增產物經 1%的瓊脂糖凝膠電泳、切膠并回收純化后連接到pMD18-T載體上, 轉化DH5α大腸桿菌, 培養過夜, PCR篩選陽性克隆后經測序獲得Foxl2基因片段。

根據NCBI網站的氨基酸序列BLAST分析, 選取一部分典型的脊椎動物物種, 經Mega5.0軟件的Neighbor-joining法構建各物種Foxl2氨基酸序列的系統進化樹, 比較中華鱉Foxl2基因與其他物種之間的親緣關系。用DNAMAN軟件對不同物種的Foxl2基因所編碼的氨基酸序列進行多重比對。

1.6 引物設計及熒光定量PCR

定量PCR引物設計跨越內含子以減少基因組DNA的影響, 各引物序列如下:Foxl2 (F: 5′-AGAA CAGCATCCGCCACA-3′, R: 5′-GGGTCCAGCG TCCAGTAGTT-3′); GAPDH (F: 5′-AGAACATCATT CCAGCATCCA-3′, R: 5′-CTTCATCACCTTCTT AATGTCGTC-3′)。

從性腺提取總RNA, 按照IScriptTMcDNA Synthesis Kit (Bio-Rad)試劑盒合成cDNA, 以合成的20 μL cDNA為模板, 使用SsoFast Eva Green (Bio-RAD公司)熒光定量試劑盒。按照以下參數配置10 μL體系: SsoFast EvaGreen supermix 5 μL, 上下游引物各0.5 μL, cDNA模板1 μL, ddH2O 3 μL, 反應液的配制在冰上操作, 每個反應3次重復, 各個樣品做3次平行實驗, 按以下參數在CFX-96實時熒光定量擴增儀進行PCR擴增: 95預變性30s; (95℃, 5s;60.2℃, 30s), 40個循環。為了保證PCR擴增和檢測的特異性(是否含有二聚體), 每個PCR反應的程序后都增加溶解曲線, 65—95℃, 5s/0.5℃。

1.7 數據分析

目的基因的相對表達量采用2-ΔΔCt法, 2-ΔΔCt值代表目的基因與對照組表達量之間的倍數差異。目的基因表達量的統計值用算數平均值±標準誤(mean±SE)表示, 用SPSS17.0軟件進行單因素方差(One-Way ANOVA)和Tukey B檢驗法統計分析。以P＜0.05作為顯著性差異;P＜0.01為非常顯著性差異;P＜0.001為極顯著差異。

2 結果

2.1 中華鱉Foxl2基因部分cDNA克隆

以卵巢組織cDNA為模板進行PCR, 產物電泳顯示一條約為903 bp的片段, 隨后經華大基因公司測序, 經NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進行序列比對, 確定為中華鱉Foxl2基因片段, 編碼大約300個氨基酸殘基。將該序列提交GenBank, 已獲得登錄號: KP734210。

根據NCBI網站的氨基酸序列BLAST程序進行中華鱉Foxl2基因與其他物種同源關系分析, 結果表明: 中華鱉與紅耳龜(Trachemys scripta)相似性最高, 達到99%; 西部錦龜(Chrysemys picta bellii)、密西西比鱷(Alligator mississippiensis)、紅原雞(Gallus gallus)次之, 分別為92%、88%和84%, 其他物種的相似性基本在66%—80%。通過DNAMAN軟件進行多重序列比對顯示Foxl2具有高度保守的FH結構域(圖 1A)。構建系統進化樹表明: 中華鱉Foxl2與同目爬行動物聚為一分支, 其中與西部錦龜遺傳距離最近(圖 1B)。

2.2 E2對雌雄中華鱉Foxl2基因表達的影響

如圖 2所示, 處理6h后雌性個體中Foxl2的表達量高于對照組, 差異不顯著(P＞0.05), 12h和24h后,E2極顯著上調雌性個體Foxl2的表達量(P＜0.001),其表達量呈現與時間相關的增加趨勢, 分別增加到對照組的8倍和18倍, 尤其在24h出現表達高峰, 至第48h和第7天時雌性個體Foxl2的表達量下降, 差異不顯著(P＞0.05); 至14d后E2又顯著提升Foxl2的表達量(P＜0.05), 達到對照組的5倍; 處理6h、24h和48h后雄性個體Foxl2的表達量低于對照組, 差異不顯著(P＞0.05), 至7d之前, E2對雄性個體Foxl2的表達影響均不顯著(P＞0.05), 至7d和14d后, E2極顯著上調Foxl2的表達量(P＜0.001), 均增加到對照組的5倍。

結果顯示: 1 mg/mL E2明顯促進雌性中華鱉Foxl2的表達, 促進高峰在24h, 隨著時間的推移其促進作用呈現減弱的趨勢; 1 mg/mL E2在注射后期促進雄性中華鱉Foxl2的表達, 其促進高峰時間比雌性個體大大延遲, 表達高峰出現在7d和14d, 且其表達量整體要低于在雌性個體中的表達量。

2.3 MT對雌雄中華鱉Foxl2基因表達的影響

如圖 3所示, 處理6h和12h后雌性個體中Foxl2的表達量高于對照組, 差異不顯著(P＞0.05);至24h之前, MT對雌性個體Foxl2的表達影響不顯著(P＞0.05), 隨著時間的延長; 至24h后, MT極顯著上調雌性個體中Foxl2的表達(P＜0.001), 出現表達高峰, 達到對照組的17倍; 至第48h、第7和第14天后,Foxl2的表達量呈現顯著下降的趨勢(P＜0.05),但均穩定在高于注射前5倍的水平。處理6h和12h后雄性個體Foxl2的表達量與對照組持平, 差異不顯著(P＞0.05); 隨著注射時間的延長, 尤其在24h,MT極顯著促進Foxl2的表達(P＜0.001), 出現表達高峰, 達到對照組的5倍; 第48h后, 其表達量低于對照組(P＞0.05); 7d后,Foxl2的表達量又出現顯著回升的趨勢(P＜0.05); 至14d后, 其表達量略微下降。

結果顯示: 1 mg/mL MT明顯促進雌性中華鱉Foxl2的表達; 除48h外, 1 mg/mL MT對雄性中華鱉Foxl2的表達呈現不同程度的促進作用, 但其作用沒有雌性明顯, 且無論雌雄, 24h時MT的促進作用最強。

3 討論

3.1 中華鱉Foxl2基因序列分析

多重序列比對顯示中華鱉Foxl2基因部分片段含有一個高度保守的FH結構域, 且與其他很多物種具有很高的相似性, 說明該結構域在不同物種生長發育過程中發揮重要作用; 同源性分析表明, 中華鱉Foxl2基因是已發現物種Foxl2基因的同源基因, 該基因在進化上具有較高的序列保守性和功能一致性; 其中與紅耳龜和西部錦龜的同源性分別達到99%和92%, 說明其在進化上與爬行類的同源性;聚類分析表明中華鱉與西部錦龜的Foxl2基因在同一大支, 而與氨基酸同源性較高的紅耳龜的Foxl2基因親緣關系較遠, 這說明Foxl2基因在進化過程中承受了不同的選擇壓力, 最終導致不同物種之間該基因的進化速率差異, 但是其在進化過程中變異還是較小, 且保守性很高, 其演化關系也與生物學結果一致。

3.2 E2對中華鱉Foxl2基因表達的影響

圖 1 Foxl2氨基酸序列比對及分子進化樹分析Fig. 1 Comparing amino acid sequence alignments and phylogenetic analysis of Foxl2

圖 2 E2對雌雄中華鱉Foxl2基因表達的影響Fig. 2 The effects of E2 on the Foxl2 expression in Pelodiscus sinensis's females and males

圖 3 MT對雌雄中華鱉Foxl2基因表達的影響Fig. 3 The effects of MT on the Foxl2 expression in Pelodiscus sinensis's females and males

在非哺乳脊椎動物中, 雌激素是卵巢分化的關鍵因素, 但其作用機制仍不甚了解。本研究結果顯示, E2促進中華鱉Foxl2基因的表達, 雌性的促進作用比雄性明顯, 且其表達高峰時間比雄性提前(提前一周), 可以判斷E2以不同的途徑調控中華鱉雌雄個體中Foxl2基因表達。目前國內外對中華鱉Foxl2基因的研究尚少見報道。多數文獻報道雌激素促進Foxl2的表達[13,14]; 降低雌激素合成或者抑制雌激素信號轉導均可顯著抑制Foxl2的表達[15,16],如南方鲇(Southern catfish)[17]、虹鱒(Rainbow trout)[18]、雞(Gallus gallus)[19]以及稀有 鯽(Gobiocypris rarus)[20]; 關于其調控機制, 有學者解釋為Foxl2基因通過激活芳香化酶(雄激素轉化為雌激素的關鍵酶)的表達, 從而共同調控雌激素的生成[21,22];哺乳動物中也有類似現象[23]; 本研究中雌性的表達結果與以上研究結果一致。雌激素信號傳導過程依賴于細胞環境和受體的存在, 即雌激素受體(ERα和ERβ)以及跨膜受體GPER(非基因組通路),基因組通路(ERα和ER)的表達水平可以發生轉換,這種轉換允許E2在不同的方向介導其作用并調節未成熟支持細胞的增殖[24]。正常雌性個體中雌激素受體及其相應原件均處于非激活狀態。從本研究結果來看E2可能通過激活雌性個體中的ERα或者ERβ來啟動相應原件(在基因轉錄水平上)上調Foxl2的表達, 當細胞內激素濃度發生改變, 則開始調動GPER來調節激素平衡。但是我們并沒有檢測內源激素水平和性腺發育狀態, 所以不能進行驗證,而且雌激素的具體作用機制比較復雜, 這也是我們后續的研究熱點。

最新研究報道, 雌激素在動物雄性個體中同樣發揮重要作用, 其中雌激素介導的ERα信號對于生殖細胞活性和維持生精上皮的正常組織至關重要。雌激素的生理水平對精子生成至關重要, 高劑量對精子發生有損傷作用, 而低劑量則對其有積極作用[24]。Hultman等[25]也發現EE2處理雄性虹鱒后,Foxl2表達水平上升。中華鱉雄性個體中Foxl2的表達水平在E2暴露7d后明顯上升, 這說明E2在雄性中華鱉生長后期發揮了重要作用, 但是對于具體機制,尚不清晰, 還需進一步研究。

3.3 MT對中華鱉Foxl2基因表達的影響

中華鱉雌雄個體注射MT后,Foxl2基因表達增強, 在24h時均出現表達高峰, 之后逐漸減弱, 其變化趨勢可能與體內外源MT有效劑量的變化相關,表明中華鱉雌雄個體以相同的節奏和強度應答外源MT, 24h是Foxl2基因應激MT的敏感時期, 且MT對雌性個體的作用比雄性強烈。

有文獻報道MT在魚類等性逆轉過程中發揮重要作用[26,27]; Fenseke和Segner[28]用10000 ng/L劑量的MT處理斑馬魚, 結果發現CYP19b表達量上升。雄激素的信號傳導過程主要依賴以下3個途徑: 直接與雄激素受體(AR)結合、或者在芳香化酶的作用下轉化為雌二醇, 隨后雌二醇與雌激素受體結合而發揮效應, 也可以轉化為二氫睪酮(DHT)。本研究結果表明Foxl2基因的表達依賴以上機制的相互作用。MT影響雌雄個體的高峰期一致, 也說明MT促進中華鱉Foxl2基因表達的性別差異較小, 但是以上機制之間的具體作用機理及如何切換我們目前還不清楚。而且MT是直接作用于Foxl2基因還是通過間接的激素平衡反饋機制, 我們也不得而知。我們推測MT暴露不久后, MT轉化為了內源性的E2, 雌雄性個體的應答機制間接轉為擬雌激素效應, 并通過干擾內源性激素的合成及代謝而發揮作用。此外還有研究表明MT抑制Foxl2基因的表達[29], 這可能由于多種因素導致, 例如所使用的性激素化合物種類不用; 所采用方法的不同; 注射時間和濃度的差異; 或者是實驗動物所處的不用發育或生理時期等因素造成的。相關研究表明, 使用外源雄激素和芳香化酶抑制劑后, 血清中E2水平下調[30—32], 但是我們沒有檢測中華鱉血清內激素含量的變化, 所以無法進行驗證, 這也是本文的不足之處。

總之, 基因在信號通道和代謝2個水平產生重要影響, 前者具有迅速而猛烈的特性, 后者具有緩沖和補償功能。在中華鱉雌性個體中, 外源性激素是以影響信號通道為主的模式來調控Foxl2表達;在雄性個體中, 外源性激素打破了中華鱉原有激素的平衡[29], 改變了原有的代謝模式, 逐漸切入信號通道。從我們的實驗中, 可以得出中華鱉雌性個體中Foxl2基因對外源性激素的應答模式趨于一致,而中華鱉雄性個體中Foxl2基因對外源性激素的應答模式存在差異, E2和MT均促進中華鱉Foxl2基因的表達。但是不能分析其具體機制及E2對雄性個體中Foxl2基因的持續作用, 希望在后續的研究中得到結果。