虹鱒Fc受體FcγR的α和γ亞基基因的克隆及表達分析

王 鵬 張 弩 張旭杰 張永安

(1. 中國科學院水生生物研究所淡水生態與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049;3. 西北工業大學生命學院, 西安 710072; 4. 華中農業大學水產學院, 武漢 430070)

Fc受體(Fc receptor, FcR)是一種表達在免疫細胞膜表面的免疫球蛋白超家族(Immunoglobulins superfamily, IgSF)成員, 它在免疫系統中起著聯系體液免疫和細胞免疫的作用[1], 其中包括傳統的FcR、多聚免疫球蛋白受體(Polymeric immunoglobulin receptor, pIgR)和Fc受體樣分子(Fc receptor like, FcRL)等[2]。總體來說, FcR通過識別免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)的單體或者復合物來激活或者抑制免疫反應[3]。目前在人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)中已經鑒定出能識別免疫球蛋白IgG的FcR (FcγR)、IgA的FcR (FcαR)、IgE的FcR(FcεR)、IgM的FcR (FcμR)和IgD的FcR (FcδR)[4—7]。

哺乳動物FcγR大多是以多亞基的復合體形式來發揮作用, 一般是由α(FcγRα)和γ(FcRγ)亞基組成二聚體結構[3]。FcγR表達在多種細胞類型中, 包括單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和血小板[8—11],在炎癥反應中起到中樞調節器的作用。當這些細胞上FcγR的FcγRα亞基與IgG的Fc段結合時, 信號傳遞給FcRγ亞基, 并通過其胞內免疫受體酪氨酸活化基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)上的酪氨酸磷酸化以激活下游信號傳導級聯反應從而發揮免疫功能, 實現對體液免疫和細胞免疫的平衡調控[12—14]。此外, FcγR還參與包括調理吞噬、介導抗體依賴的細胞毒作用、清除免疫復合物、細胞激活、釋放炎癥因子和活性氧等在內的各種細胞免疫反應, 以及參與免疫球蛋白的轉運和抗體中和[15—19]。總之, FcγR參與調節多種先天性和適應性免疫反應。在人和小鼠中, 根據與IgG親和力的不同, FcγR可以分為高親和力的FcγRI (RIA、RIB、RIC)以及低親和力的FcγRII(RIIA、RIIB、RIIC)和FcγRIII (RIIIA、RIIIB), 此外, 在小鼠中還發現了能特異性識別IgG2a和IgG2b的受體FcγRIV[20—22]。在牛(Bos taurus)、羊(Ovis aries)、豬(Sus scrofa)和馬(Equus caballus)等家畜動物中也有相關FcR被克隆鑒定[23—26], 且表現出了一些特有的序列特征。例如, 在牛中存在的只能特異識別IgG1的FcγR, 在豬中發現的FcγRIIIA包含有和抗菌肽cathelicidin家族同源的序列[27,28]。另外,也有研究發現人的郎格罕細胞能表達可溶的FcγR(sFcγRIIA)[29]。

在非哺乳動物的鳥類和兩棲類中也發現了FcR的同源基因[30,31]。而有關魚類FcγR的研究最近才有相關報道。2000年, Fujiki等[32]首次在鯉(Cyprinus carpio)中發現跟人和小鼠FcRγ高度同源的分子; 2006年, Stafford等[33]首次在斑點叉尾魚回鮰(Ietalurus punetaus)中克隆得到在結構和功能上跟哺乳動物FcγRα具有同源性的FcRL (IpFcRI), 并且發現它能夠跟IgM的Fc段特異性結合。然而迄今為止, 有關虹鱒(Oncorhynchus mykiss)FcγR基因的克隆鑒定尚未見報道。虹鱒屬鮭形目鮭科冷水性魚類, 肉質鮮嫩、味美無腥, 無小刺, 蛋白質、脂肪和不飽和脂肪酸含量高, 現已被我國列為淡水養殖的優良品種[34]。本文以虹鱒為研究對象克隆得到FcγR的α和γ亞基, 研究了其序列和結構特征以及組織和細胞亞群表達分布, 這不僅為研究FcR在脊椎動物中的進化提供了數據支持, 也為今后研究虹鱒FcγR的免疫功能奠定了分子基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用的虹鱒來自湖北荊門漳河水庫虹鱒養殖場, 實驗前暫養于中國科學院水生生物研究所控溫樓。虹鱒的具體飼養條件同文獻[35]。

健康狀態下虹鱒組織樣品的采集取3尾健康虹鱒(50—70) g, 麻醉后依次取血液、頭腎、脾臟、胸腺、后腸、皮膚、鰓、肝臟、心臟、肌肉和腦組織, 液氮中凍存。

誘導狀態下虹鱒組織樣品的采集將健康虹鱒分為三組, 第一組腹腔注射100 μL無菌PBS, 第二組腹腔注射100 μL LPS (E. coli0111∶B4; 1 mg/mL,溶解于PBS; Sigma-Aldrich), 第三組腹腔注射100 μL poly (I∶C)(1 mg/mL, 溶解于PBS; Sigma-Aldrich)。隨后分別于0、12h、24h、72h和168h各取3尾魚,麻醉后取頭腎組織, 液氮中凍存。

1.2 FcγRα和FcRγ亞基cDNA全長的擴增

RNA的提取與cDNA第一鏈的合成用Trizol試劑(Invitrogen)從上述組織樣品中提取總RNA并反轉錄成cDNA, 詳細方法見文獻[35]。

FcγRα和FcRγ亞基cDNA中間片段的同源克隆根據虹鱒的cDNA文庫分別獲得FcγRα和FcRγ亞基的部分cDNA序列, 設計特異性引物(表 1)。以頭腎cDNA為模板分別PCR擴增FcγRα和FcRγ亞基cDNA的中間片段。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 由武漢擎科生物科技有限公司完成測序[36]。

FcγRα和FcRγ亞基cDNA序列3′-和5′-末端擴增根據獲得的FcγRα和FcRγ亞基cDNA中間部分序列, 設計特異性引物(表 1)。以頭腎cDNA為模板, 進行RACE-PCR, 獲得3′-和5′-末端序列, 再與中間序列拼接得到全長cDNA序列, 最后在非翻譯區(Untranslated region, UTR)設計引物(表 1)來驗證拼接的全長cDNA序列。PCR產物經電泳、膠回收、連接、轉化后將陽性克隆送交擎科公司測序, 具體操作參照本課題組前期研究[36]。

表 1 本文中所用的引物序列Tab. 1 Primers used in the present study

續表 1

1.3 FcγRα和FcRγ亞基序列的生物信息學分析

利用ExPASy在線翻譯工具(http://web.expasy.org/translate/)將獲得的cDNA序列翻譯成對應的氨基酸序列, 用SignalP 4.1 Server程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析信號肽, 用TMHMM Server v. 2.0程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測跨膜區, 用SMART在線軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)預測蛋白質的結構域。用ClastalW2.1軟件多重比對氨基酸序列; 使用MEGA 7.0中的鄰接法(Neighbor-joining)構建系統進化樹, 自舉置換(Bootstrap)1000次計算各分支的置信度。

1.4 FcγRα和FcRγ亞基基因的表達模式分析

通過CFX ConnectTMReal-Time PCR儀(Bio-Rad)檢測FcγRα和FcRγ基因在虹鱒不同組織和不同細胞亞群中的表達水平,EF-1a基因為內參基因, 實時熒光定量PCR (Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)引物的擴增效率及特異性檢測同文獻[37]。qRTPCR體系及程序如下: 稀釋后的cDNA模板4 μL、SsoAdvancedTMSYBR Green Supermix (Bio-Rad)5 μL、250 nmol/L反向引物各0.5 μL, 總反應體系10 μL。擴增反應條件如下: 95℃ 3min, (95℃ 20s、60℃20s、72℃ 20s)45個循環, 最后從65℃到95℃添加溶解曲線。每個組織或細胞樣品設3個重復, 結果采用2-ΔΔCt法計算。

1.5 虹鱒頭腎和外周血組織中白細胞亞群的流式分選

用注射器從虹鱒尾靜脈取血后立即用DMEM培養液(添加100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素和 25 U/mL肝素鈉)按照1∶5稀釋; 虹鱒頭腎組織經研磨后輕輕穿過尼龍網(網眼直徑為100 mm), 然后用上述DMEM培養液同比例稀釋; 將4 mL細胞懸液緩慢加入連續Percoll (GE)梯度(34%/51%)上, 4℃400×g在水平轉頭上離心30min, 收集頭腎白細胞(Head kidney leukocyte, HKL)和外周血白細胞(Peripheral blood leukocyte, PBL), 加入6 mL含肝素鈉的DMEM培養液洗滌2次。分別加入mouse anti-trout IgM (IgG1亞型)和mouse anti-trout IgT (IgG2b亞型)(一抗), 冰上孵育30min, 小鼠IgG作為陰性對照,然后加入APC-goat anti-mouse IgG1和FITC-goat anti-mouse IgG2b (二抗), 避光在冰上孵育30min,PBS洗滌2次后, 用BD FACSAria Ⅲ流式細胞儀分選髓樣細胞(Myeloid cells, Mye)、IgM+B細胞、IgT+B細胞和雙陰性(Double negative, DN)淋巴細胞, 提取總RNA并反轉錄成cDNA, 采用qRT-PCR進行表達分析。具體實驗操作見文獻[38]。

1.6 LPS或poly (I∶C)刺激后頭腎組織中FcγRα和FcRγ基因的表達變化

按照上文方法, 用LPS或poly (I∶C)刺激虹鱒,檢測頭腎中FcγRα和FcRγ基因在不同時間點的表達變化, 分析FcγR是否參與了虹鱒的免疫應答。qRTPCR的引物和流程同1.4, 結果采用2-ΔΔCt法計算, 實驗數據采用SPSS 19.0軟件統計分析(P＜0.05為顯著差異,P＜0.01為極顯著差異)。

2 結果

2.1 FcγRα和FcRγ基因cDNA序列分析

利用RACE技術克隆得到虹鱒FcγR的α亞基基因FcγRα, 其cDNA (GenBank登錄號: MG993321)全長1667 bp, 包含2個多聚腺苷酸化信號(AATAAA),開放閱讀框(Open reading frame, ORF)為954 bp, 編碼317個氨基酸(Amino acid, aa)。蛋白結構分析顯示它含有一個信號肽(aa1—aa19)和2個免疫球蛋白結構域即D1(aa36—aa117)和D2(aa125—aa200)(圖1A)。虹鱒FcγR的FcRγ亞基具有2種形式, FcRγ1和FcRγ2(包含FcRγ2a和FcRγ2b兩個剪接異構體), 其中FcRγ1的cDNA (GenBank登錄號: MG993322)全長為665 bp, ORF為279 bp, 編碼92個aa (圖 1B);FcRγ2a的cDNA (GenBank登錄號: MG993323)全長為701 bp, ORF為342 bp, 編碼113個aa (圖 1C);FcRγ2b的cDNA (GenBank登錄號: MG993324)全長為509 bp, ORF為300 bp, 編碼99個aa (圖 1D)。蛋白結構分析顯示它們均具有信號肽、跨膜區和胞內ITAM基序等特征結構。

2.2 FcγRα和FcRγ同源性比較分析與系統進化樹構建

圖 1 虹鱒FcγRIα (A)、FcRγ1 (B)、FcRγ2a (C)和FcRγ2b (D)的cDNA及預測氨基酸序列Fig. 1 cDNA and predicted amino acid sequences of trout FcγRIα (A)、FcRγ1 (B)、FcRγ2a (C) and FcRγ2b (D)

氨基酸序列多重比對硬骨魚類的FcγRα亞基,結果顯示虹鱒FcγRα與大西洋鮭FcγRα(Salmo salar,ACN10664.1)的相同率最高(85.92%), 與其他硬骨魚類FcγRα相同率為30%—40%。虹鱒FcγRα的信號肽跟其他硬骨魚類的差異較大, D1和D2結構域在不同硬骨魚類間相對較為保守, 且所有硬骨魚類FcγRα都缺失跨膜區和胞質區(圖 2A)。虹鱒FcRγ各亞型中, FcRγ1與其余2個亞型的氨基酸序列相同率分別為40.98%和45.37%(表 2), 而FcRγ2b相比FcRγ2a僅缺失14個氨基酸(圖 2B); 氨基酸序列多重比對顯示, FcRγ的跨膜區和ITAM區在硬骨魚類中非常保守, 虹鱒FcRγ1氨基酸序列與其他硬骨魚類以及人類的同源序列的相同率為38.83%—42.57%(圖 2B)。

系統進化樹結果顯示, 硬骨魚類的FcγRα聚為一支, 哺乳動物的FcγRα聚為另一支, 且虹鱒與大西洋鮭的親緣關系最近, 這與其分類地位一致(圖 3A)。用不同類型的FcRγ構建系統進化樹(圖 3B), 結果表明虹鱒FcRγ與斑馬魚(Danio rerio)、鯉(Cyprinus carpio)和鲇(Silurus asotus)等硬骨魚類親緣關系較近, 而與哺乳動物的親緣關系較遠, 此外虹鱒FcRγ2a和FcRγ2b聚為一亞支, 而虹鱒FcRγ1與斑馬魚的同源序列聚為另一亞支(圖 3B)。

2.3 FcγRα和FcRγ基因在虹鱒組織和細胞中的表達分析

虹鱒FcRγ存在FcRγ1和FcRγ2兩種形式, 其基因分別位于9號和8號染色體上, FcRγ2a和FcRγ2b是FcRγ2基因轉錄表達的不同剪接異構體(圖 4)。與FcRγ2a相比, FcRγ2b在其ITAM基序前面僅缺失14個氨基酸殘基(圖 2B), 因此我們只能采用一對qRT-PCR引物來檢測FcRγ2a和FcRγ2b的共表達模式。結果顯示FcRγ1在各組織中表達量最高, 其次是FcRγ2a/2b, 且FcRγ1和FcRγ2a/2b在淋巴組織中的表達量要顯著高于非淋巴組織, 其中脾臟表達量最高, 其次是頭腎和外周血; 而FcγRα僅在外周血、頭腎和脾臟等淋巴組織中有較高表達, 其余組織僅有微弱表達(圖 5)。

圖 2 虹鱒FcγRα與其他魚類相應分子氨基酸序列比對(A)和虹鱒FcRγ與其他物種相應分子氨基酸序列比對(B)Fig. 2 Amino acid alignment of trout FcγRα with the related sequences in other fish (A); Amino acid alignment of trout FcRγ with the related sequences in other species (B)

表 2 虹鱒FcRγ各亞型間氨基酸序列相同率Tab. 2 Amino acid sequence identity between the subunit of FcRγ in rainbow trout

圖 3 脊椎動物FcγRα(A)和FcRγ(B)氨基酸序列的系統進化樹Fig. 3 Phylogenetic analysis of amino acid sequences of vertebrate FcγRα (A) and FcRγ (B)

采用流式細胞術從虹鱒PBL和HKL中分選得到IgM+B細胞群、IgT+B細胞群、DN淋巴細胞群和Mye細胞群。qRT-PCR結果顯示,FcγRα、FcRγ1和FcRγ2a/2b均在Mye細胞群中表達量最高,其次是DN細胞群, 在IgM+和IgT+B細胞群僅有少量表達; 在Mye細胞群中FcRγ1表達量最高, 在DN淋巴細胞群中FcRγ2a/2b表達量最高(圖 6)。

2.4 Poly (I∶C)或LPS刺激后頭腎組織中FcγRα和FcRγ基因表達分析

圖 4 虹鱒FcRγ1(A)基因預測結構示意圖和FcRγ2(B)基因及其轉錄產物的預測結構示意圖Fig. 4 A schematic diagram shows the predicted geneorganization of FcRγ1 (A) and FcRγ2 (B) and the transcripts of FcRγ2

圖 5 虹鱒FcγR基因的組織表達分布Fig. 5 Expression patterns of FcγR in different tissues of rainbow trout

圖 6 虹鱒頭腎白細胞(A)和外周血白細胞(B)各亞群FcγR基因的表達分布Fig. 6 Expression patterns of FcγR in the cell subpopulations of trout head kidney leukocytes (HKL, A) and trout peripheral blood leukocytes (PBL, B)

LPS是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分, 它能在動物體內引起強烈的免疫反應。為了研究FcγR基因在虹鱒抗細菌過程中的免疫作用, 我們采用qRT-PCR檢測了虹鱒受LPS刺激后不同時間點FcγRα和FcRγ基因在頭腎組織中的表達變化情況。結果顯示, 受LPS刺激后FcγRα、FcRγ1和FcRγ2a/2b基因在頭腎中均呈現先上調后下降的表達趨勢。其中FcγRα在刺激12h后表達量開始升高, 并在24h達到峰值(P＜0.05); 與對照組相比,FcRγ1在刺激12h后表達量有所升高, 但相比對照組其差異并不顯著;FcRγ2a/2b在刺激12h后表達量顯著升高(P＜0.05), 在24h達到峰值; 所有基因的表達在刺激168h后開始呈現下降趨勢并逐漸恢復到正常水平(圖 7A)。

作為雙鏈RNA的類似物, Poly (I∶C)可以模擬病毒感染, 誘導機體產生抗病毒的免疫反應。qRTPCR結果顯示poly (I∶C)可以誘導FcγRα、FcRγ1和FcRγ2a/2b基因的表達, 其中FcγRα的表達在刺激12h后顯著上調(P＜0.05)并在24h達到峰值, 在刺激72h后開始下調;FcRγ1和FcRγ2a/2b的表達在刺激12h后達到峰值(P＜0.05), 24h后下調到正常水平(圖 7B)。

3 討論

圖 7 虹鱒頭腎組織中FcγR基因在LPS (A)或poly (I∶C)(B)刺激下不同時間點的表達水平Fig. 7 Expression analysis of FcγR in the head kidney for trout stimulated with LPS (A) or Poly (I∶C) (B)

哺乳動物Fc受體FcγR是由FcγRα和FcRγ亞基以非共價鍵形式形成聚合物發揮免疫功能的[39]。在本研究中, 我們克隆了虹鱒FcγR的FcγRα和FcRγ亞基的cDNA序列。虹鱒的FcγRα亞基由2個免疫球蛋白樣結構域構成, 沒有跨膜區和胞內區,暗示本研究獲得的虹鱒FcγRα亞基很可能是一種分泌型的可溶蛋白。可溶性的FcR (Soluble Fc receptor, sFcR)是通過mRNA的選擇性剪切或者細胞膜型FcR通過蛋白酶解作用產生[40]。在哺乳動物中,sFcR不僅可以阻遏抗體復合物與膜表面表達FcR的細胞的結合, 下調B細胞的增殖和抗體分泌, 還可以通過結合補體受體來激活細胞[41—43]。在斑點叉尾鮰血清中用多克隆抗體可以檢測到FcR蛋白, 證實了sFcR在硬骨魚類中也存在[33], 由此推斷虹鱒FcγRα亞基或許可以形成sFcR, 從而發揮免疫作用。氨基酸序列比對結果顯示硬骨魚類FcγRα亞基的免疫球蛋白樣結構域相似度很高, 表明硬骨魚類FcγRα亞基在進化中十分保守。與此同時, 本研究還鑒定了虹鱒FcRγ亞基的2種亞型, 它們均具有信號肽、跨膜區及胞內ITAM基序。氨基酸序列比對結果顯示虹鱒FcRγ亞基與代表性脊椎動物的FcRγ亞基相似度非常高, 表明FcRγ亞基在進化中非常保守。

FcγRα基因主要在虹鱒的淋巴組織中表達, 而在非淋巴組織中的表達水平明顯較低, 比如心臟、腮、肝臟和肌肉, 其組織表達模式與已報道的斑點叉尾鮰的FcR基因的表達模式[33]基本一致, 表明FcγRα可能在魚類免疫系統中扮演重要角色。FcRγ基因在虹鱒各組織中的表達水平都要高于FcγRα基因, 這可能與FcRγ也可作為其他FcR (如FcαR、FcεR和FcμR等)的亞基以及激活信號元件有關[44]。FcRγ1基因在大部分淋巴組織中的表達水平均高于FcRγ2a/2b基因, 表明FcRγ1可能在虹鱒免疫系統中具有更廣泛的作用。在人和小鼠中,FcγR基因主要在樹突狀細胞、單核細胞和巨噬細胞以及絕大多數的中性粒細胞中表達, 而不在淋巴細胞中表達[45], 而有關硬骨魚類FcγR的表達細胞類型卻甚少報道。本研究結果表明虹鱒的FcγR基因主要表達在頭腎和外周血的髓樣細胞(包含樹突狀細胞、單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞等)中,其表達細胞類型和哺乳動物中相似。

在硬骨魚類中, 頭腎被認為是類似于哺乳動物骨髓的中樞免疫器官, 在免疫系統中起重要作用[46]。在本研究中, LPS和Poly (I∶C)刺激后虹鱒FcγRα基因在頭腎中的表達水平顯著上調, 預示FcγRα在魚類抗細菌和抗病毒免疫過程中發揮重要作用[47]。FcRγ1和FcRγ2a/2b基因在頭腎中的表達在受刺激后12h也達到峰值, 表明魚類FcRγ亞基可能通過ITAM參與了抗細菌和抗病毒免疫信號的傳導過程。

總而言之, 本研究克隆的虹鱒Fc受體FcγR的亞基基因(FcγRα和FcRγ)廣泛表達于各種組織中, 特別是包括外周血、頭腎和脾臟在內的淋巴組織中。此外, 從頭腎和外周血白細胞中分選得到的亞細胞群中, FcγR的亞基基因主要表達在髓樣細胞群, 而且在受到LPS和Poly (I∶C)刺激后虹鱒頭腎組織中FcγR的亞基基因的上調表達說明該基因參與了抗細菌和抗病毒的免疫反應。然而, 虹鱒FcγR在細胞和體液免疫中的具體功能還需要進一步探究。