HPLC測定長柄扁桃仁及餅粕中苦杏仁苷與野黑櫻苷

郭咪咪，朱琳，段章群，張東，李秀娟，李曉寧

（國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京 100037）

苦杏仁苷（amygdalin）是一種糖苷化合物，主要存在于杏、桃、蘋果、李子、山楂等植物的種仁中，被苦杏仁酶、櫻葉酶等β-葡萄糖甙酶水解，依次生成野黑櫻苷（prunasin）和杏仁腈（mandelonitrile），杏仁腈再分解生成苯甲醛和氫氰酸（HCN）[1]。少量的氫氰酸能夠起到鎮咳平喘功效，但在人體內積累一定量后會抑制酶活性，進而抑制組織細胞呼吸，導致死亡[2]。氫氰酸對人的急性致死量為0.5～3.5 mg/kg體重，在食用木薯淀粉衛生指標和飼料衛生標準中均有其限量要求，而目前氫氰酸的含量主要是通過測得的苦杏仁苷質量換算而得到。因此，長柄扁桃仁或餅粕作為食品、藥品或飼料時，必須嚴格控制苦杏仁苷含量，進而減少有害降解產物氫氰酸的安全風險。目前苦杏仁苷含量測定方法國內外已有文獻[3～6]報道，但在苦杏仁苷與降解物、液相法同時測定苦杏仁苷和中間產物野黑櫻苷含量等方面的報道研究較少，本文旨在建立一種高效準確的苦杏仁苷與野黑櫻苷的高效液相色譜測定方法。

本文基于2010年版中國藥典一部及相關文獻[7,8]，優化高效液相色譜測定長柄扁桃仁與餅粕中苦杏仁苷及其降解產物-野黑櫻苷的方法，同時對長柄扁桃仁與餅粕中苦杏仁苷和野黑櫻苷提取工藝進行優化，確定長柄扁桃仁、餅粕中苦杏仁苷與野黑櫻苷的含量，進而達到明確有害降解產物氫氰酸含量的目的。與相關研究相比，本方法的含量測定范圍中包含了飼料衛生標準中HCN的限量值，而且能夠同時準確檢測苦杏苷與中間降解產物野黑櫻苷含量，為高效液相色譜測定長柄扁桃仁及其系列產品中苦杏仁苷與野黑櫻苷提供依據，為長柄扁桃仁系列產品的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

長柄扁桃仁樣品采自我國陜西省神木。

甲醇、乙腈、純水為色譜級，石油醚為分析純，苦杏仁苷標準品（≥96%），Sigma公司，野黑櫻苷標準品（≥95%），Sigma公司等。

中草藥粉碎機jx-600，天津市泰斯特儀器有限公司；分析天平（0.0001 g）、數控超聲波清洗器KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司；紫外可見分光光度計TU-1810，北京普析通用儀器有限公司；高效液相色譜儀（配置紫外檢測器）1100，Agilent公司；低速大容量多管離心機、漩渦振蕩器、慢速定量濾紙等。

1.2 試驗方法

1.2.1 苦杏仁苷、野黑櫻苷標準品溶液的制備

分別準確稱取12.5 mg苦杏仁苷與5.0 mg野黑櫻苷標準品，甲醇溶解，分別定溶于25 mL、10 mL容量瓶中，即分別得到質量濃度均為500 μg/mL的苦杏仁苷與野黑櫻苷甲醇標準儲備液，4 ℃儲存備用。分別吸取2 mL各標準儲備液至不同10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，即得100 μg/mL苦杏仁苷標準溶液和100 μg/mL野黑櫻苷標準溶液，4 ℃儲存備用。

1.2.2 色譜條件

色譜柱為Aglient ZORBAX SB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相為20%甲醇和80%水，流速為1 mL/min；進樣量為10 μL；檢測波長為210 nm；柱溫為30 ℃。

1.2.3 樣品前處理

長柄扁桃仁系列產品包括長柄扁桃仁、長柄扁桃油和長柄扁桃餅、粕。液壓制備長柄扁桃油得到的長柄扁桃餅，當含油量≥8%時采取1.2.3.1樣品處理方法，而含油量＜8%時采取1.2.3.2樣品處理方法。長柄扁桃油在所研究樣品中未檢測到苦杏仁苷和野黑櫻苷，所以本研究以長柄扁桃仁和餅、粕為主。

1.2.3.1 長柄扁桃仁樣品前處理

準確稱取0.20 g經粉碎機粉碎的長柄扁桃仁或長柄扁桃餅（含油量≥8%），置于50 mL已稱重的具塞離心管中，加入10 mL石油醚（30～60 ℃沸程），超聲10 min，4000 r/min離心10 min，棄去石油醚層，殘渣重復提取兩次。待殘渣中溶劑過夜靜置揮干，稱重后按料液比1：200準確加入甲醇，稱重，在功率為100%的超聲波作用下提取30 min，冷卻至室溫，稱重，甲醇補足損失的重量，搖勻，過濾，棄去前1 mL過濾液，收集續濾液。續濾液用20%甲醇稀釋5倍，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，進樣。

1.2.3.2 長柄扁桃粕樣品前處理

準確稱取0.10 g長柄扁桃粕或經粉碎機粉碎的長柄扁桃餅（含油量＜8%），置于50 mL已稱重的具塞離心管中，準確加入20 mL甲醇，稱重，超聲（功率100%）提取30 min，冷卻至室溫，稱重，甲醇補足損失的重量，搖勻，過濾，棄去前1 mL過濾液，收集續濾液，續濾液用20%甲醇稀釋5倍，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，進樣。

1.2.4 數據統計分析

文中苦杏仁苷與野黑櫻苷的提取得率按公式（1）計算：

其中：c-從標準曲線中計算得到的待測液濃度，單位μg/mL；N-稀釋倍數；V-樣品提取液的體積，單位mL；m-稱樣質量，單位g。

文中數據采用Excel軟件進行分析與作圖，數據結果用平均值±標準偏差表示。

2 結果與討論

2.1 色譜條件優化

2.1.1 檢測波長

將苦杏仁苷標準溶液與 20%甲醇溶液混合，在190～400 nm波段下掃描。該溶液在210 nm波長附近有最大吸收，確定210 nm為苦杏仁苷的檢測波長。

圖1 乙腈水流動相下苦杏仁苷色譜圖Fig.1 The amygdalin chromatograms under acetonitrile and water as flow phase

圖2 乙腈水甲醇流動相下苦杏仁苷色譜圖Fig.2 The amygdalin chromatograms under acetonitrile,methanol and water as flow phase

圖3 甲醇水流動相下苦杏仁苷色譜圖Fig.3 The amygdalin chromatograms under methanol and water as flow phase

圖4 甲醇水流動相下野黑櫻苷色譜圖Fig.4 The prunasin chromatograms under methanol and water as flow phase

2.1.2 流動相

比較了乙腈-水[9]、乙腈-水-甲醇[10～12]、甲醇-水[13,14]作為流動相對苦杏仁苷標準品溶液色譜峰分離效果。結果表明，在流動相為18%乙腈和82%水時，苦杏仁苷標準品可得到兩個相鄰色譜峰（圖1的5～10 min之間），且第一個色譜峰峰型較差；當流動相為2%乙腈、85%水和13%甲醇時，苦杏仁苷標準品色譜峰（圖2）與18%乙腈和82%水作為流動相時的相似；而當流動相為20%甲醇和80%水時，苦杏仁苷色譜峰（圖3約11 min處）為一個色譜峰，且分離較好，繼續此色譜條件檢測野黑櫻苷標準品溶液，均可得到不同于苦杏仁苷色譜峰位置的一個野黑櫻苷色譜峰（圖 4約 19 min處），同時，此色譜條件能夠達到兩標準品色譜峰均有較好的峰型（符合峰型對稱性要求）和分離效果的目的。

2.2 苦杏仁苷提取條件優化

2.2.1 提取溶劑

苦杏仁苷的三水合物為斜方柱狀結晶（水），可溶于水、乙醇，幾乎不溶于乙醚。藥典[15]中選用甲醇、甲醇/水或乙醇/水溶液作為苦杏仁苷提取溶劑，寇凱等[10]研究得出甲醇提取苦杏仁苷，提取得率約為乙醇的5倍。本實驗中研究了不同比例甲醇/水溶液（20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、70%甲醇、80%甲醇、90%甲醇、100%甲醇）對長柄扁桃粕中苦杏仁苷及其降解物的提取特性。結果表明，20%、40%甲醇提取液中未檢測到苦杏仁苷和野黑櫻苷（以20%甲醇提取液為例，如圖 5）。其它不同濃度甲醇/水提取液測定結果如圖6所示。

圖5 20%甲醇提取液色譜圖Fig.5 The chromatograms of 20% methanol extract

圖6可以看出，甲醇含量越高，苦杏仁苷提取得率越大，野黑櫻苷提取得率越小。當甲醇含量≥90%時，提取溶液中幾乎檢測不到野黑櫻苷。說明水的存在可能對苦杏仁苷有分解作用，產生分解產物野黑櫻苷，所以研究選取甲醇作為提取溶劑，盡量避免降解原料中苦杏仁苷成分。同時對圖5中相對保留時間在21.9 min和35.6 min的物質成分進行了分析并確定為其降解產物成分。

甲醇提取液在色譜條件下有前延峰現象，選擇色譜流動相（20%甲醇）稀釋，色譜峰峰型較好，與錢平[16]等研究結果一致。

圖6 甲醇含量對苦杏仁苷、野黑櫻苷提取得率影響Fig.6 Effects on extraction rates of the amygdalin and prunasin from the methanol content

圖7 超聲時間對苦杏仁苷提取得率的影響Fig.7 Effects on extraction rates of the amygdalin from ultrasonic time

圖8 料液比對苦杏仁苷提取得率的影響Fig.8 Effects on extraction rates of the amygdalin from solid-liquid ratio

2.2.2 提取時間對長柄扁桃粕中苦杏仁苷與野黑櫻苷的影響

采用甲醇提取長柄扁桃粕中苦杏仁苷與野黑櫻苷，實驗表明，純甲醇溶劑浸提長柄扁桃粕，提取液中不含有苦杏仁苷的降解產物-野黑櫻苷。當提取溫度為20 ℃、料液比1：100、超聲功率200 W時，分別考察提取時間10、20、30、40、50 min對苦杏仁苷提取得率的影響。圖7可知，苦杏仁苷的提取得率隨提取時間的延長而增加，當提取時間達到30 min、40 min時，苦杏仁苷提取得率變化不明顯；而提取時間為50 min時，提取得率有增加。考慮當提取時間由30 min延長到50 min時，提取得率增加0.2%，而提取時間過短又容易導致提取不充分。綜合考慮能耗和提取得率因素，試驗最終確定最佳提取時間為30 min。

2.2.3 料液比對長柄扁桃粕中苦杏仁苷與野黑櫻苷的影響

長柄扁桃仁和長柄扁桃餅（含油量≥8%）經石油醚超聲去油、干燥后，甲醇超聲浸提。試驗研究不同料液比（長柄扁桃粕 g/甲醇 mL）對長柄扁桃粕中苦杏仁苷及其降解產物提取特性影響。按1.2.3.2樣品前處理，稱樣 5 份，分別以料液比 1：50、1：100、1：150、1：200和1：250超聲提取后測定提取得率。結果如圖8所示：長柄扁桃粕中苦杏仁苷的提取得率隨料液比增加呈先增大后減小趨勢，當料液比達1：200時，提取得率最高5.77%（質量百分含量）。這可能是因為在料液比較低時，溶液中滲透壓較低，溶質不容易浸出，導致提取得率較低；當增大料液比，滲透壓變大，提取得率隨之增大；但當增加到一定值時，溶液中滲透壓對提取得率的影響不顯著，所以導致提取得率不再繼續增大。因此，確定最佳料液比為1：200。

2.3 方法學評價

2.3.1 線性關系和檢出限

以20%甲醇為溶劑，將500 μg/mL的苦杏仁苷標準儲備液分別稀釋成0.5、1、5、10、20、50、100、200、300 μg/mL標準溶液，進樣量10 μL，以質量濃度（x）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標作圖，得回歸方程y=9.9868x-1.6653，R2=0.9999（n=3）。說明在0.50～300 μg/mL范圍內有良好的線性關系。

樣品（編號RCS11）長柄扁桃粕由于其特殊制油工藝，粕中同時含有苦杏仁苷（平均質量含量約3%）和野黑櫻苷（平均含量約0.29 mg/g）兩種成分。在上述分析條件下，根據其色譜信息，以信噪比S/N=3計，得苦杏仁苷檢測限為0.2 μg/mL；以信噪比S/N=10計，得苦杏仁苷定量限為 0.4 μg/mL。在飼料衛生標準[17]中，HCN在飼料原料最低限量為50 mg/kg，相當于苦杏仁苷限量為 845 mg/kg（苦杏仁苷與氫氰酸換算系數16.9），在本方法的定量限內。

以20%甲醇為溶劑，將500 μg/mL的野黑櫻苷標準儲備液進一步稀釋成0.3、0.5、1、5、10、20、50、100 μg/mL標準溶液，進樣量10 μL，以質量濃度（x）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標作圖，得回歸方程y=15.796x-1.177，R2=0.9999（n=3）。說明在0.30～100 μg/mL范圍內有良好的線性關系。

在上述分析條件下，根據RCS11樣品色譜信息，以信噪比S/N=3計，得野黑櫻苷檢測限為0.1 μg/mL；以信噪比S/N=10計，得野黑櫻苷定量限為0.2 μg/mL。

2.3.2 精密度

吸取100 μg/mL的苦杏仁苷標準溶液10 μL注入色譜儀，同一色譜條件下連續進樣6次，測得峰面積分別為：1031.2、1026.0、1027.7、1036.8、1060.9、1043.9，相對偏差（RSD）1.26%，說明色譜分析苦杏仁苷的方法具有良好的精密度。

吸取10 μg/mL的野黑櫻苷標準溶液10 μL注入色譜儀，同一色譜條件下連續進樣6次，測得峰面積分別為：158.0、155.1、150.0、150.4、151.7、149.4，相對偏差（RSD）2.23%，說明色譜分析野黑櫻苷的方法具有良好的精密度。

2.3.3 重復性

2.3.3.1 長柄扁桃粕

稱取編號為CS35的長柄扁桃粕樣品6份，按照1.2.3.2和1.2.2的方法操作。試驗表明，樣品CS35中只含有苦杏仁苷成分，不含野黑櫻苷。記錄苦杏仁苷峰面積分別為 608.1、588.7、605.5、590.4、603.6、589.8。苦杏仁苷平均含量5.58%，RSD為1.39% (n=6)，表明該方法重復性良好。

2.3.3.2 長柄扁桃仁

稱取編號為RCS25的長柄扁桃仁樣品6份，按照1.2.3.1和 1.2.2的方法操作。試驗測定表明，樣品RCS25中只含有苦杏仁苷成分，不含野黑櫻苷。記錄苦杏仁苷峰面積分別為484.0、499.2、460.8、483.5、462.0、497.0。苦杏仁苷平均含量2.45%，RSD為3.13%(n=6)，表明方法重復性良好。

2.3.4 平均加標回收率

2.3.4.1 長柄扁桃粕中平均加標回收率

表1 長柄扁桃粕中平均加標回收率及RSDTable 1 The amygdalin and prunasin recoverys from Amygdalus pedunculata Pall meal and its RSD（n=3）

表2 長柄扁桃仁中平均加標回收率及RSDTable 2 The amygdalin and prunasin recoverys from Amygdalus pedunculata Pall kernel and its RSD（n=3）

稱取長柄扁桃粕（苦杏仁苷質量含量5.67%，野黑櫻苷未檢出）10份，每3份作為一組，三組分別加入2.5、5.5、10.0 mg的苦杏仁苷標準品，再分別加入0.1、0.2、0.5 mg的野黑櫻苷標準品，1份留做空白，按照1.2.3.2方法處理，液相測定。計算長柄扁桃粕中平均加標回收率，結果見表1。

表1可知，甲醇（100%甲醇）溶液做提取劑，苦杏仁苷平均加標回收率98.32%～107.99%，野黑櫻苷平均加標回收率107.58%～117.60%，說明純甲醇溶液能同時提取出樣品中的苦杏仁苷和野黑櫻苷兩種物質。同時證實了 2.2.1中低甲醇含量的提取液中由于水的存在，使部分苦杏仁苷降解為野黑櫻苷，如圖 6，低含量甲醇溶液中野黑櫻苷含量最高，苦杏仁苷含量最低，而純甲醇提取液中只有苦杏仁苷，說明此樣品中只含有苦杏仁苷成分。

2.3.4.2 長柄扁桃仁平均加標回收率

稱取長柄扁桃仁（苦杏仁苷含量2.19%，野黑櫻苷未檢出）10份，每3份作為一組，三組分別加入4.0、5.5、10.0 mg的苦杏仁苷標準品，再分別加入0.1、0.2、0.5 mg的野黑櫻苷標準品，1份留做空白，按照1.2.3.1方法處理，液相測定。計算長柄扁桃仁中平均加標回收率，結果見表 2，苦杏仁苷平均加標回收率87.10%～96.19%，RSD為4.46%～7.83%（n=3）；野黑櫻苷平均加標回收率 88.65%～103.10%，RSD為3.03%～7.55%（n=3）。

3 結論

本研究采用甲醇提取長柄扁桃仁及長柄扁桃餅、粕中的苦杏仁苷及其降解產物，確定了各原料的提取方法，并建立了高效液相色譜測定其中苦杏仁苷及野黑櫻苷含量的方法。長柄扁桃仁中苦杏仁苷平均加標回收率 87.10%～96.19%（RSD 為 4.64%～7.83%），野黑櫻苷為88.65%～103.10%（RSD為3.03%～7.55%）；長柄扁桃粕中苦杏仁苷平均加標回收率98.32%～107.99%（RSD為1.44%～3.36%），野黑櫻苷為 107.58%～117.60%（RSD 為 1.45%～2.26%），精密度1.26%，具有較好的重現性、較高的回收率和準確性等。方法的建立對長柄扁桃及其副產物的開發具有很好的指導意義，對木本油料產業的發展具有更強的推進作用。