副豬嗜血桿菌微滴數(shù)字PCR定量檢測方法的建立

石磊，溫雯，李麗麗

（暨南大學(xué)食品安全與營養(yǎng)研究院，廣東廣州 510632）

副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)是豬上呼吸道的一種常在菌。在一定條件下可引起嚴(yán)重的全身性疾病，以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為主要特征，該病原引起的疾病又稱為格氏病[1,2]。副豬嗜血桿菌有15個以上血清型[3]，血清1、5、10、12、13和14型是引發(fā)豬發(fā)病和死亡的強毒血清型；血清型2、4和15是可引起多發(fā)性漿膜炎的中等獨立型；血清型8屬于弱毒力型，血清型3、6、7、9和11為不引起臨床癥狀的無毒力型，我國以血清4和5型流行最多[4,5]。副豬嗜血桿菌病死亡率較高，病發(fā)后不易治愈，病死率高達50%[6]。該病傳染性強，且多與其他病原如豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒等混合感染，嚴(yán)重危害仔豬和青年豬的健康[7]。該病在我國已呈現(xiàn)出流行趨勢，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[8,9]。為此，建立早期快速檢測方法對副豬嗜血桿菌感染的預(yù)防和控制具有十分重要的意義。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）提出至今已有20年時間，在此期間，PCR也已發(fā)展成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的一項常規(guī)且關(guān)鍵的技術(shù)，并且極大地推動著生命科學(xué)各領(lǐng)域的發(fā)展[10]。目前，實驗室常用的檢測副豬嗜血桿菌的方法有細(xì)菌分離、血清學(xué)診斷技術(shù)[11]和分子生物學(xué)檢測技術(shù)（常規(guī)PCR[12]，實時熒光定量PCR[9]和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)[13]等）。傳統(tǒng)的細(xì)菌分離和血清學(xué)檢測方法，存在耗時長、對檢測人員技術(shù)要求高、操作復(fù)雜以及敏感性差等諸多不足。PCR操作復(fù)雜，需對結(jié)果進行跑膠分析，且靈敏度較低；實時熒光PCR需使用昂貴的儀器設(shè)備并依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量檢測，靈敏度仍存在一定的局限性；環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)由于引物間的非特異性擴增而易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）是近十年來興起的第三代PCR技術(shù)[14,15]，其原理是將預(yù)混的PCR反應(yīng)體系進行微滴化處理，形成幾萬至幾十萬個油包水的液化微滴中，保證每個微滴中含有一個或不含有核酸模板，經(jīng)過PCR擴增后，經(jīng)過熒光檢測每個微滴中的陽性微滴數(shù)和陰性微滴數(shù)，根據(jù)泊松分布原理即可計算出核酸模板的初始拷貝數(shù)[16]。與實時熒光 PCR相比，該方法采用直接計數(shù)目標(biāo)分子數(shù)而不依賴任何校準(zhǔn)物或外標(biāo)，通過計數(shù)單個分子從而實現(xiàn)絕對定量[17]，故而具有精準(zhǔn)、靈敏度超高和不易受PCR抑制物影響等優(yōu)點[18]。本研究旨在建立特異、靈敏、準(zhǔn)確的HPS ddPCR的定量檢測方法，并與傳統(tǒng)qPCR進行比較，以期為HPS定量檢測提供新方法和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株

HPS、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureu）由本實驗室保存；豬圓環(huán)病毒 2型（Porcine circovirus2，PCV2）疫苗、豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）滅活疫苗、豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）購自廣東永順生物制藥有限公司。

1.1.2 主要試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、病毒RNA/DNA小量提取試劑盒，購自廣州美基生物科技有限公司；AceQ qPCR Probe Master Mix，HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+g DNA wiper），購自南京諾維贊生物技術(shù)有限公司；ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)、Droplet Generation Oil for Probes，購自美國Bio-Rad公司。

1.1.3 主要設(shè)備

NanoDrop veu plus核酸蛋白分析儀，美國Thermo公司；ABI QuantStudio 6 Flex實時熒光定量PCR儀，美國 ABI公司；QX200微滴式數(shù)字 PCR儀，美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 探針和引物設(shè)計

根據(jù)HPS的OMP P2基因[19]保守區(qū)，使用Primer Premier 3.0設(shè)計合成特異性的real-time PCR引物探針，擴增片段為65 bp。所有引物、探針和質(zhì)粒均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，見表1。

表1 引物和探針序列Table 1 Primer and probe sequences

1.2.2 核酸的提取

按照Magen細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取 HPS、SS、APP、B.subtilis、E.coli、Salmonella、S.aureu的DNA；按照Magen病毒RNA/DNA小量提取試劑盒說明書提取PCV2的DNA，CSFV的RNA，并按照HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+g DNA wiper）的說明書將CSFV的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，均保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 qPCR反應(yīng)體系和條件

采用設(shè)計好的引物和探針建立實時熒光定量PCR方法，qPCR總反應(yīng)體系為20 μL，包括：AceQ qPCR Probe Master Mix 10 μL；上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL；探針（10 μmol/L）0.2 μL；模板 1 μL；ddH2O 8 μL。擴增條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，共30個循環(huán)。將質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋，檢測后用于繪制qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 ddPCR反應(yīng)體系和條件優(yōu)化

ddPCR設(shè)置引物濃度400～900 nmol/L、探針濃度100～300 nmol/L、退火溫度 55～65 ℃，加入 ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) 10 μL，用水補足至20 μL，進行ddPCR擴增，擴增條件為：95 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s，55～65 ℃ 1 min，40 個循環(huán)；98 ℃ 10 min；4 ℃ 60 min，升降溫速率 2 ℃/s。通過比較ddPCR的微滴生成數(shù)，微滴分布狀態(tài)、微滴熒光信號的強度等來確定優(yōu)化的結(jié)果。

1.2.5 特異性試驗

分別以HPS、PCV2、APP、SS、B.subtilis、E.coli、Salmonella、S.aureu的DNA以及CSFV的cDNA為模板，按照優(yōu)化后體系進行ddPCR檢測，驗證特異性。

1.2.6 重復(fù)性試驗

用已優(yōu)化好的 ddPCR方法進行重復(fù)性試驗。在20 μL的反應(yīng)體系中加入1 μL稀釋好的模板，重復(fù)3次ddPCR 試驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 qPCR方法建立

將2.647×1010copies/μL的HPS質(zhì)粒進行10倍倍比稀釋，以此為模板作熒光定量PCR，得到熒光定量PCR擴增曲線，見圖1。結(jié)果表明：qPCR可檢測到2.647×102copies/μL的質(zhì)粒DNA，表明其靈敏性較好。

圖1 qPCR擴增HPS的曲線圖Fig.1 Amplification curve for Haemophilus parasuis by qPCR

2.2 反應(yīng)條件的確定

確定最佳ddPCR引物探針濃度和擴增條件為：引物的濃度為 400 nmol/L，探針濃度為 200 nmol/L。ddPCR擴增條件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，55 ℃1 min，40 個循環(huán)；98 ℃ 10 min；4 ℃ 60 min，升降溫速率2 ℃/s。

2.3 液滴數(shù)字PCR擴增

當(dāng)液滴數(shù)字 PCR擴增生成的微滴數(shù)目在 12000以上，表明微滴反應(yīng)正常，可以對其進行后續(xù)的定量分析。由圖2a可知，經(jīng)過優(yōu)化的ddPCR反應(yīng)體系對HPS的擴增結(jié)果較好，微滴散點圖中陰陽性微滴分界明顯。且由圖2b可知，陽性微滴和陰性微滴明顯分為兩簇，中間彌散的微滴數(shù)目很少，表明其擴增效果良好。本實驗中，HPS DNA 初始模板為 2.647×105copies/μL，隨著 DNA模板濃度降低，陽性微滴數(shù)量相應(yīng)減少。由圖3可知，經(jīng)過優(yōu)化的反應(yīng)條件適合進行HPS ddPCR的定量分析。

圖2 ddPCR擴增HPS的圖Fig.2 Amplification map of Haemophilus parasuis by ddPCR

圖3 HPS ddPCR擴增不同濃度模板的微滴散點圖Fig.3 ddPCR amplification of droplet scatter plots of different concentration templates

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低檢測限

ddPCR和qPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別見圖4和圖5。由圖可知，ddPCR的R2值為0.9955，斜率為-0.886，最低檢測限為 2.647 copies/μL。qPCR 的 R2值為0.9917，斜率為-1.406，最低檢測限為26.47 copies/μL。結(jié)果表明：ddPCR和qPCR的線性關(guān)系均較好，ddPCR最低檢測限低于qPCR。

圖4 ddPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 ddPCR standard curve

圖5 qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 qPCR standard curve

2.5 特異性分析

圖6 ddPCR的特異性實驗Fig.6 Specificity test of ddPCR

采用 HPS、APP、SS、PCV2、B.subtilis、E.coli、Salmonella、S.aureu的DNA和CSFV的cDNA進行ddPCR特異性驗證。結(jié)果表明：除了HPS特異性擴增，其他檢測均為陰性，說明該方法特異性較好。

2.6 重復(fù)性分析

3次重復(fù)試驗得到 ddPCR的結(jié)果分別為 1854 copies/μL，1839 copies/μL，1953 copies/μL。變異系數(shù)為3.29%，說明該方法的重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，檢測結(jié)果穩(wěn)定、可靠。

2.7 臨床樣品的檢測

利用本實驗建立的ddPCR和qPCR方法分別對53份從豬場采集的樣品進行檢測。結(jié)果顯示：53份樣本中，qPCR檢出48份陰性，2份為陽性樣本（Ct值23～28），3份為可疑樣本（Ct值33～35）；ddPCR方法檢出的48份陰性樣本，5份陽性樣本。兩者檢測結(jié)果基本一致。結(jié)果表明：本實驗建立的 ddPCR方法和qPCR方法都能檢測相應(yīng)結(jié)果，而ddPCR結(jié)果更加可靠和精確。

表2 臨床樣品檢測結(jié)果Table 2 Detection result of field samples

3 結(jié)論

3.1 傳統(tǒng)的數(shù)字PCR是進行絕對核酸量化的方法，它基于在有限稀釋的條件下將各個分析物分子分配成許多重復(fù)反應(yīng)的絕對核酸定量方法，在大多數(shù)反應(yīng)中產(chǎn)生1個或0個分子。終點PCR后，模板的起始濃度通過泊松分布統(tǒng)計分析確定陽性（含有擴增的靶標(biāo)）和陰性（未擴增的靶標(biāo)檢測的反應(yīng)）。數(shù)字 PCR比qPCR具有許多潛在的優(yōu)勢。近來，該技術(shù)已經(jīng)商業(yè)化，將反應(yīng)分為納米級大小的液滴。數(shù)千個液滴的快速微流體分析每個樣品使ddPCR適用于常規(guī)使用，并大大提高了系統(tǒng)的實際動態(tài)范圍（對每個液滴的多個目標(biāo)分子進行泊松校正）[20]。

3.2 李富祥等[21]建立了基于TaqMan探針的副豬嗜血桿菌實時熒光定量 PCR檢測方法，其靈敏度為 692 copies/μL。Wei Xiaoyuan等[19]建立了副豬嗜血桿菌恒溫?zé)晒釶CR檢測技術(shù)，靈敏度可達到1000 copies/μL。本實驗建立的實時熒光定量 PCR檢測方法的最低檢測限為26.47 copies/μL，ddPCR的最低檢測限為2.647 copies/μL。

3.3 本試驗建立了一種定量檢測HPS的ddPCR方法，同時，利用ddPCR和qPCR這2種檢測方法對HPS進行測定，就靈敏性、重復(fù)性、特異性和臨床樣品檢測 4個方面進行了比較。在定量檢測相同稀釋度的HPS DNA時，ddPCR和qPCR的定量值呈線性正相關(guān)，且ddPCR方法的靈敏性優(yōu)于qPCR。在實際運用過程中，ddPCR方法的檢出率更加可靠。

3.4 數(shù)字液滴PCR也存在一些不足，例如儀器設(shè)備昂貴，每份樣品的檢測成本較實時熒光PCR高；微滴讀取速度慢導(dǎo)致檢測時間是實時熒光PCR的2～3倍；熒光通道少（目前只有FAM、HEX、VIC通道）；樣品需稀釋到一定濃度方可檢測等[22]。但是，隨著未來數(shù)字液滴PCR儀器成本的下降、技術(shù)的成熟，該技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。

3.5 總之，本試驗建立的 ddPCR方法靈敏度高、重復(fù)性好，特異性強，可進行HPS低含量樣品檢測和定量檢測。為HPS的檢測、流行病學(xué)調(diào)查、質(zhì)控等提供了一個切實可行的解決方案。