1-MCP處理延緩采后機械傷青圓椒的衰老進程

王云香，劉瑤，李雪松.，張慧君，左進華，高麗樸，史君彥，王清

（1.北京市農(nóng)林科學院 蔬菜研究中心，農(nóng)業(yè)部蔬菜產(chǎn)后處理重點實驗室，果蔬農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工北京市重點實驗室，農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室，農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點實驗室，北京 100097）（2.淮北師范大學生命科學學院,安徽淮北 235000）

果蔬從采后包裝、運輸、貯藏最后到消費的整個過程中，會受到跌落、擠壓、震動、碰撞等各種機械損傷[1,2]，機械損傷能導致果蔬生理代謝紊亂，引發(fā)一系列不利于貯藏的生理生化反應。同時，機械損傷降低了果蔬外觀質量和食用品質，破壞果蔬組織細胞膜系統(tǒng)和細胞結構的完整性，導致有關代謝物質改變，發(fā)生酶促褐變等一系列異常生理生化變化，加速果蔬采后衰老進程。損傷部位給微生物侵染提供了機會，使腐爛速率加快，造成品質下降，貯藏期變短，造成一系列的經(jīng)濟損失，嚴重的影響了經(jīng)濟效益[3,4]。采后果蔬受機械傷害的生理生化反應主要包括乙烯生成、呼吸速率變化、膜脂過氧化、愈傷組織和次生物質生成五個方面[5]。目前，人們對果實機械傷的研究主要集中于明確某一種機械傷給果實所造成的影響，并從2個方面探索解決方法：一是通過研究果實力學特性和規(guī)律，尋求減少果實受力的技術措施，以預防和減輕果實機械損傷；二是通過研究采后技術，調節(jié)果實生理特性，降低果實對機械傷的敏感性，以減輕機械傷給果實帶來的影響[6]。

1-MCP（1-methylcyclopropane，甲基環(huán)丙烯）是一種有效的乙烯受體抑制劑，有無生理毒性、無異味、穩(wěn)定性好、易于合成、使用濃度低、殘留氣味較小等優(yōu)點[7]。1-MCP與果蔬組織中的乙烯受體結合，阻斷乙烯與受體的結合，阻止或延緩乙烯的生理作用。在國內(nèi)，關于1-MCP對青圓椒采后機械傷的生理生化影響十分少見。本實驗主要研究1-MCP處理對采后青圓椒機械損傷后貯藏過程中一些生理生化指標的影響，為 1-MCP在青圓椒貯藏運銷保鮮的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用品種為京甜3號，采收當天運回實驗室，挑選大小均一，無病蟲害、無機械損傷、成熟度均勻的新鮮的青圓椒為試材。

1-MCP購自上海鮮達生物科技有限公司，氣體純度92%。

保鮮膜：0.03 mm PE膜，由北京華盾雪花有限公司提供。

1.2 試驗處理

1.2.1 青圓椒預處理

挑選好的青圓椒采用高處墜落法模擬機械損傷，從距地面1 m的高處墜落，然后以不同濃度1-MCP（8 μL/L、10 μL/L）熏蒸 24 h。預實驗發(fā)現(xiàn) 10 μL/L 1-MCP處理效果最佳。根據(jù)此條件，正式實驗的青圓椒隨機均分為2組，A組和B組。A組和B組均從距地面1 m的高處墜落，在室溫下（T=20 ℃，H=80%～85%）對A組青圓椒用10 μL/L 1-MCP熏蒸24 h。將處理后的A組和未處理的B組青圓椒裝入0.03 mm厚度的PE保鮮袋中，每袋裝5個青圓椒，折口包裝后于20 ℃下貯藏，每隔3 d測定相關生理生化相關指標。實驗重復三次，所測數(shù)據(jù)取平均值。

1.2.2 主要儀器設備

UV-1800分光光度計，島津；D-3752冷凍離心機(Thermo Fisher Scientific)；XMTD-6000型數(shù)顯恒溫水浴鍋，余姚金電儀表有限公司；DYY-6D型電泳儀，北京市六一儀器廠；德國IKA A11 basic分析研磨機，上海川翔生物科技有限公司；PCR儀，德國耶拿分析儀器股份公司；Nano Drop 2000微量分光光度計，北京科譽興業(yè)科技發(fā)展有限公司；凝膠成像儀，上海創(chuàng)萌生物科技有限公司；Light Cycler 480Ⅱ實時熒光定量PCR系統(tǒng)。

1.2.3 測定指標和方法

MDA含量的測定采用Jin[8]等的方法。樣品組織用 10 mL 100 g/L三氯乙酸(TCA)溶液勻漿，4 ℃13000 r/min下離心30 min，在10 mL 試管中一次加入2 mL上清液、2 mL 0.67% TBA混勻，于沸水裕中20 min，冷卻，然后測定450 nm、560 nm和600 nm處吸光值。

葉綠素含量測定采用Deng[9]等的方法稍作修改。青圓椒組織用4 ℃的丙酮：乙醇(2：1)溶液勻漿，在通風櫥內(nèi)避光過濾至50 mL棕色容量瓶中，至青圓椒勻漿組織變白，然后定容至刻度，測定66 nm和645 nm處吸光值。

VC含量測定采用鉬酸銨比色法[10]。樣品組織用10 mL 0.05 mol/L草酸-EDTA溶液勻漿，于 4 ℃13000 r/min下離心30 min，在10 mL試管中一次加入2 mL上清液、3 mL草酸-EDTA、0.5 mL偏磷酸-乙酸、1 mL 5% H2SO2和2 mL 5%鉬酸銨混合，于80 ℃水浴鍋中水浴10 min，取出冷卻至室溫，用蒸餾水定容至1 mL，然后測760 nm處的吸光值。

POD（過氧化物酶活性）測定采用愈創(chuàng)木酚法[11]反應體系為0.3% H2O21 mL、0.2%愈創(chuàng)木酚0.9 mL、pH 7.8 PBS 1 mL和酶液0.1 mL，測定470 nm處吸光值。

CAT活性測定采用 Azevedo[12]等的方法稍作修改，稱取1 g樣品于研缽中，加入8 mL提取緩沖液，在冰浴條件下研磨成勻漿，然后轉入離心管中于4 ℃、13000 r/min離心30 min，收集上清液即為酶提取液，低溫保存?zhèn)溆?。反應體系包括0.3% H2O21 mL、pH 7.8 PBS 1.9 mL和酶液0.1 mL，用紫外分光光度計測定240 nm處吸光值。以每克果蔬樣品（鮮重）每分鐘吸光度變化值增加0.01為1個CAT活性單位。

APX（抗壞血酸過氧化物酶活性)測定采用Wang[13]等方法，樣品組織用8 mL 0.1 mol/L pH 7.5的PBS緩沖液提取，4 ℃ 13000 r/min下離心30 min，上清液為粗酶提取液，反應體系包含反應緩沖液 2.6 mL、酶液0.1 mL和2 mmol/L H2O20.3 mL，測定290 nm處的吸光值。

Real-time Q-PCR分析抗氧化酶基因表達：RNA的提取方法參照 Invitrogen生物公司提供的說明書，將冷凍樣品至于液氮中，取0.1 g的粉末與1 mL Trizol試劑混合，提取總RNA。用Super Script TM Ш反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。以cDNA為模板進行RT-PCR的檢測，采用96孔板點樣，使用Light Cycler 480 Ⅱ儀器測定，用2-△△Ct法相對定量。利用Primer 5.0軟件設計引物，以UBI-3作為內(nèi)參基因，POD、CAT、APX為目的基因，由上海生物工程有限公司完成引物的合成。引物設計序列見表1。

表1 內(nèi)參和目的基因表達的引物序列Table 1 The sheet of primer sequence of endoginseng and target gene expression

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本實驗利用EXCEL 2010統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)整理，利用Origin 9.0作圖，利用IBM SPSS Statistics 22軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗（p＜0.05為差異顯著；p＜0.01為差異極顯著）。

2 結果與分析

2.1 1-MCP處理對機械損傷青圓椒葉綠素含量的影響

顏色是青椒果實外觀品質的重要指標，隨著青椒的衰老果實開始轉紅。葉綠素是構成青椒綠色的主要成分[14]，青圓椒在包裝、包裝、貯藏過程中極易受到機械損傷，影響食用價值和商業(yè)價值。由圖1可知，青圓椒果實的葉綠素含量隨貯藏時間的增加呈明顯下降的趨勢。第12 d時，對照組和1-MCP處理組果實的葉綠素含量分別為0.49 mg/g和0.52 mg/g，1-MCP處理組的葉綠素含量顯著高于對照組的葉綠素含量（p＜0.05）。對照組和1-MCP處理組的葉綠素含量在貯藏期間持續(xù)下降，0～3 d快速下降，但1-MCP處理組比對照組下降緩慢。1-MCP處理組的葉綠素含量始終高于對照組的葉綠素含量，說明1-MCP處理對于青圓椒機械損傷后葉綠素的降解有一定的抑制作用，可以延緩葉綠素的降解。

圖1 1-MCP處理對青圓椒機械傷后葉綠素含量的影響Fig.1 Effect of 1-MCP treatment on chlorophyll content of green bell pepper

2.2 1-MCP處理對機械損傷青圓椒維生素 C含量的影響

維生素C是廣泛存在于水果蔬菜中的重要維生素之一，維生素C的含量可作為果蔬抗衰老的重要指標[15]。青圓椒含有較高的維生素C，機械損傷會使青圓椒中的維生素C快速降解。由圖2可知，在貯藏初期，青圓椒的維生素C含量下降速率較緩慢，從第9 d開始，青圓椒維生素C含量快速下降。貯藏期間，對照組和1-MCP處理組的維生素C含量呈現(xiàn)均呈現(xiàn)下降趨勢，但1-MCP處理組維生素C含量始終高于對照組，貯藏的第12 d和15 d，對照組和1-MCP處理組的維生素C含量分別為1.58 mg/g、1.74 mg/g和1.47 mg/g、1.62 mg/g，差異顯著（p＜0.05）。在貯藏的18 d和21 d，對照組和1-MCP處理組維生素C含量分別降低至1.34 mg/g、1.56 mg/g和1.47 mg/g，差異極顯著（p＜0.01）。結果表明，在整個貯藏過程中，1-MCP對抑制機械損傷青圓椒維生素C的降低有十分明顯的效果，對受到機械損傷的青圓椒進行1-MCP處理有助于減少維生素C含量的降低。

圖2 1-MCP處理對青圓椒機械傷后維生素C含量的影響Fig.2 Effect of 1-MCP treatment on VC content of green bell pepper

2.3 1-MCP處理對機械損傷青圓椒MDA含量的影響

圖3 1-MCP處理對青圓椒機械傷后MDA含量的影響Fig.3 Effect of 1-MCP treatment on MDA content of green bell pepper

MDA是細胞膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，其含量是評判細胞膜損傷程度的重要標志之一[16]。由圖3可知，在貯藏期間，對照組和1-MCP處理組的MDA含量先逐漸升高，并在第6 d達到峰值，分別為0.087 nmol/L和0.083 nmol/L。在第6 d后，對照組和1-MCP處理組的 MDA含量又緩慢下降，1-MCP處理組的MDA含量達到最低0.065 nmol/L。在整個貯藏期間，1-MCP處理組的機械傷青圓椒MDA含量一直低于對照組，說明，對含有機械損傷的青圓椒進行 1-MCP處理，可以有效的延緩MDA的積累。

2.4 1-MCP處理對機械損傷青圓椒APX酶活性和APX基因表達量的影響

圖4 1-MCP處理青圓椒機械傷后對抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性和APX基因表達量的影響Fig.4 Effect of 1-MCP treatment on APX activity and gene expression of green bell pepper

APX是以抗壞血酸為電子供體的專一性強的過氧化物酶，催化抗壞血酸與H2O2發(fā)生氧化還原反應，以使抗壞血酸氧化形成單脫氫抗壞血酸，同時 H2O2被分解消除，提高細胞抗氧化系統(tǒng)還原勢，對外界的氧化脅迫、不良環(huán)境、病蟲害侵染等作出反應[17]。由圖4可知，在貯藏期間，APX的活性先緩慢上升后快速下降。對照組和1-MCP處理組的APX活性在0～6 d內(nèi)上升，并于第6 d達到峰值，分別為53.35 U/(g·min)、56.65 U/(g·min)，在第6 d之后迅速下降。1-MCP處理組的APX活性顯著高于對照組，在第12 d以后，處理組與對照組兩者差異極其顯著（p＜0.01）。由圖4可知，1-MCP處理組的APX的基因表達量始終高于對照組，兩者差異極其顯著。APX基因表達量具有與APX酶的活性相似的變化趨勢，均為先升高再持續(xù)下降。由以上結果可表明，對有機械損傷的青圓椒進行1-MCP處理，可以有效的延緩APX活性的降低。

2.5 1-MCP處理對機械損傷青圓椒POD酶活性和POD基因表達量的影響

POD是活性較高的適應性酶，能夠反映植物生長發(fā)育的特點、體內(nèi)代謝狀況及對環(huán)境的適應性，POD有清除H2O2的作用[18]。由圖5可知，對照組和1-MCP處理組的POD活性均呈先上升后下降的趨勢，1-MCP處理組的POD活性一直高于對照組。對照組和1-MCP處理組的POD活性均于第9 d達到峰值。在第15 d和18 d，1-MCP處理組的POD活性顯著高于對照組，差異極其顯著（p＜0.01）。由POD基因表達量可以得出，POD基因表達量與POD酶的活性變化趨勢相似，呈先上升后下降趨勢，且1-MCP處理組的POD的基因表達量均高于對照組的POD基因表達量。第9 d后，對照組和1-MCP處理組差異極其顯著（p＜0.01）。由此可以得出，用1-MCP處理機械損傷青圓椒，可以延緩有效 POD活性的下降，削弱膜脂過氧化作用，起到保護細胞膜的作用。

圖5 1-MCP處理青圓椒機械傷后過氧化物酶（POD）活性和POD基因表達量的影響Fig.5 Effect of 1-MCP treatment on POD activity and gene expression of green bell pepper

2.6 1-MCP處理對機械損傷青圓椒CAT酶活性和CAT基因表達量的影響

CAT是植株體內(nèi)廣泛存在的可以清除活性氧的膜保護酶類，它能把活性氧轉變成低活性物質，進而保護細胞膜系統(tǒng)[19]。由圖6可知，在青圓椒果實的貯藏過程中，CAT的活性先升高后下降，并于第9 d達到峰值，1-MCP處理組的活性一直高于對照組，且差異極顯著（p＜0.01）。在貯藏期間內(nèi)，1-MCP處理組的CAT的基因表達量均高于對照組，并于第9 d達到峰值，第9 d后，兩者之間差異顯著（p＜0.05）。對照組和1-MCP處理組的CAT基因表達量具有與CAT酶活性相似的變化趨勢，于第9 d達到峰值活性。由此可得出，用1-MCP處理機械損傷青圓椒可以顯著延緩CAT活性的下降，并減弱膜脂過氧化作用，保護細胞膜。

圖6 1-MCP處理青圓椒機械傷后過氧化氫酶（CAT）活性和CAT基因表達量的影響Fig.6 Effect of 1-MCP treatment on CAT activity and gene expression of green bell pepper

3 結論

水果和蔬菜在采前和采后都會受到不同程度的機械損傷。采前機械損傷少有規(guī)律可尋，較為嚴重的機械損傷一般發(fā)生在采收以后[20]，當蔬菜類果實受到機械傷等外界損傷脅迫時，降解反應、膜脂過氧化等一系列生理生化反應會造成果實體內(nèi)積累大量的自由基，并傷害果實細胞。目前，1-MCP在果蔬貯藏保鮮方面的應用越來越廣泛[21]。本試驗結果表明，在20 ℃的貯藏溫度下采用1-MCP處理京甜3號，并可以有效減緩果實中葉綠素的降解和維生素C含量的下降，提高一些抗機械傷脅迫物質的活性或含量。用 1-MCP處理含有機械損傷的青圓椒，有效抑制了MDA含量的增加，以上結果說明，1-MCP處理可以有效提高植物的抗脅迫性，并保護細胞膜脂，從而維持了細胞結構和功能的相對穩(wěn)定性。與對照組相比，青圓椒果實在受到人工模擬機械傷后，10 μL/L 1-MCP處理能顯著提高抗氧化系統(tǒng)保護酶類POD、CAT、APX的活性，以及抗氧化酶基因的相對表達量，且抗氧化酶基因的相對表達趨勢與酶活性變化趨勢相似，說明 1-MCP處理可能直接或間接地清除植物體內(nèi)的自由基，進而減輕外界機械損傷脅迫對植物果實細胞造成的傷害，保持青圓椒貯藏期的品質，延長其貯藏保鮮期。