玫瑰茄花色苷的純化及其熱降解穩定性

余以剛，梁澤明，萬志超，梁宇思，余祥雄，王成，張青

（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）

玫瑰茄(Hibiscus sabdariffaL.)又被稱為洛神花、山茄等，是錦葵科本植物，原產于西非和印度[1]。近年來，玫瑰茄被廣泛種植于南美洲、中美洲、西亞、東南亞等地，在我國則主要分布于廣東、福建和臺灣等地區。玫瑰茄屬于傳統的藥食同源植物，商業上的玫瑰茄花主要是指其花期的花萼，其外觀紫紅黑亮、非常誘人。

玫瑰茄花萼含有豐富的花色苷、有機酸、多酚、礦物質和維生素[2]，被廣泛用來制作冷熱飲料、茶劑、果醬、果脯、汽水等，是墨西哥和非洲大宗消費品，中國人稱其茶劑為洛神花茶。據報道，玫瑰茄花色苷的主要成分是飛燕草素-3-接骨木二糖苷、矢車菊素-3-接骨木二糖苷等[3～6]，是天然安全色素的重要來源。從該植物提取的天然色素可作為食品工業的著色、調味添加劑。玫瑰茄有降血壓[7,8]、降血脂[9,10]、抗腫瘤[11,12]、抑制肥胖癥[13,14]、糖尿病[15]等功效，具有很高的藥用價值。

玫瑰茄花色苷粗提物含有多糖、蛋白等雜質，需要進一步的分離純化。大孔吸附樹脂純化工藝簡單、安全性強、重復利用率高，可以有效地去除其中的雜質。相比于其他樹脂，AB-8型大孔樹脂具有價格低廉、純化效率高等特點，在純化花色苷上應用十分廣泛。因此本實驗選擇AB-8型大孔樹脂來純化玫瑰茄花色苷，并對其純化的條件進行優化。此外，花色苷不穩定，在食品貯藏與加工過程中受到溫度、pH、氧化劑和金屬離子等因素的影響易發生降解[16～19]。尤其是溫度，花色苷對溫度非常敏感，在熱加工的過程中容易發生降解[20～23]。據報道，花色苷在熱降解的過程中遵循一級動力學[24,25]。海藻酸鈉、羧甲基纖維素（Carboxymethylcellulose，CMC）和β-環糊精具有良好的食用安全性及生物相容性，是食品工業中應用極其廣泛的穩定劑。這些穩定劑能有效地減緩光、熱等外界不利因素對花色苷的破壞。在水溶液中，穩定劑分子中間會形成相對疏水的空腔，有機化合物能夠部分或完全進入該空腔中而形成包埋絡合物[26]。穩定劑也可以作為風味載體而降低風味物質氧化、光熱誘導分解的風險。此外，穩定劑還可以延長食品的保質期并掩蓋食品中不良風味。在花色苷溶液中添加穩定劑，既可以起到增稠、改善口感的作用，又能增強花色苷的穩定性。研究表明[27]，在玫瑰茄花色苷溶液中添加β-環糊精，能有效地減緩了花色苷的熱降解和氧化降解。

本試驗對大孔樹脂分離純化玫瑰茄花色苷的條件進行了優化并研究了添加海藻酸鈉、羧甲基纖維素、β-環糊精對玫瑰茄花色苷熱穩定性的影響，建立其熱降解動力學模型并探究熱加工過程中花色苷的L*、a*、b*值的變化，為有效控制玫瑰茄花色苷在加熱過程中的降解提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玫瑰茄，采自湖南高產奇和醫藥合富農業有限公司，去核后凍干備用；AB-8型大孔樹脂，天津波鴻樹脂科技有限公司；乙酸鈉、氯化鉀、無水乙醇、鹽酸和氫氧化鈉等均為分析純。

DFY-500型中藥粉碎機，上海新諾儀器設備有限公司；層析柱(1.8 cm×30 cm)，上海亞榮生化儀器廠；7110型酸度計，德國 WTW；分析天平，歐洲RADWAG；2L-AREI旋轉蒸發器，上海皓莊儀器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；6000LDI恒流泵，美國康諾（CoMetro）；SCIENTZ-10N型真空冷凍干燥機，北京松源華興生物技術有限公司；HYGRPLAB CR-400手持色差儀，Konica Minolta公司。

1.2 方法

1.2.1 玫瑰茄花色苷提取

將玫瑰茄凍干花萼粉碎后過 20目篩，按料液比1：30加入60%乙醇浸提過夜（約12 h）。真空抽濾后繼續用 60%乙醇沖洗濾渣，合并兩次濾液。40 ℃下旋蒸并冷凍干燥后得到花色苷粗提物。

1.2.2 玫瑰茄花色苷純化

樹脂預處理：AB-8大孔樹脂先用無水乙醇浸泡24 h，充分溶脹，然后用無水乙醇沖洗至無白色渾濁現象為止，最后用蒸餾水洗至無醇，再抽濾吸干樹脂中水分。

靜態吸附測定：準確稱取已預處理樹脂5.0 g于錐形瓶中，稱取0.1 g玫瑰茄凍干粉末，用蒸餾水稀釋至100 mL，520 nm下測其濃度C0。將錐形瓶置于恒溫振蕩器上30 ℃、100 r/min振蕩24 h，待充分吸附后，抽濾，得濾液的濃度C1，吸附率α=（C0-C1）/C0×100%。

靜態吸附動力學曲線測定：準確稱取已預處理樹脂5.0 g于錐形瓶中，稱取0.1 g凍干粉末，用蒸餾水稀釋至100 mL，520 nm下測其濃度C0。將錐形瓶置于恒溫振蕩器上30 ℃、100 r/min振蕩，每30 min測定溶液的濃度Cj，繪制靜態吸附動力學曲線。

吸附等溫線：準確稱取已預處理樹脂5.0 g于錐形瓶中，加入不同濃度的花色苷溶液各50 mL，置于振蕩器30 ℃、100 r/min上下振蕩3 h，待吸附平衡后測定溶液的平衡質量濃度，并計算吸附量，以吸附量對濃度作圖，繪制吸附等溫曲線。

上樣流速對AB-8大孔樹脂吸附效果的影響：稱取0.1 g凍干粉末，用蒸餾水稀釋至100 mL，520 nm下測其濃度C0。然后取 100 mL的稀釋粗提液流經AB-8樹脂柱，分別采用不同的流速（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min），待樣品液全部通過樹脂柱后，測定流出液的濃度C1，通過（C0-C1）/C0×100%計算吸附率。

泄漏曲線的測定：稱取5 g預處理的樹脂，濕法裝柱，用一定濃度的花色苷溶液進行吸附，流出液用接收器接收，每10 mL收集一次流份，測定其濃度，當流出液的濃度達到上樣液濃度的 1/10時認為已經有花色苷類物質透過，停止上樣，繪制泄漏曲線。

乙醇濃度對AB-8大孔樹脂解吸的影響：已吸附飽和的樹脂分別用體積分數為20%、40%、60%、80%和100%的乙醇溶液進行洗脫，靜態解析時用100 mL乙醇解析3 h，動態解析時用100 mL乙醇以1 mL/min的流速沖柱洗脫，記錄洗脫的花色苷溶液的濃度。

解吸流速對AB-8大孔樹脂解吸效果的影響：原始濃度C0的花色苷V0被吸附飽和后，用100 mL 60%的乙醇洗脫飽和吸附樹脂，分別控制不同的流速（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min），記錄洗脫的花色苷溶液的濃度C1和體積V1，通過（C1*V1）/（C0*V0）×100%計算吸附率。

1.2.3 色價測定[28]

精確稱取自制的花色苷產品0.1 g，用pH 1.0氯化鉀緩沖液稀釋至100 mL，再吸取10 mL，用氯化鉀緩沖液稀釋至 100 mL，在最大吸收波長處測定其吸光值，計算公式為：

式中：A為吸光度，W為樣品的質量（g），r為測定吸光度時所吸取樣品的稀釋倍數。

1.2.4 花色苷回收率測定

純化后回收的過程中，需要計算花色苷回收率，計算公式如下：

回收率（%）=實際回收花色苷質量/理論回收花色苷質量

1.2.5 不同穩定劑的玫瑰茄花色苷溶液的熱處理

稱取一定量的純化后的玫瑰茄花色苷凍干粉，配制成1 g/L的花色苷溶液，用0.2 mol/L Na2HPO4和0.1 mol/L檸檬酸緩沖液配制成pH=2.2的花色苷溶液，分裝5個帶帽試管中，每個試管中的花色苷溶液體積均為20 mL，其中海藻酸鈉、CMC和β-環糊精均按濃度比取 1.0%，分別放置在 80 ℃、90 ℃恒溫水浴鍋和100 ℃的恒溫油浴鍋中，避光加熱150 min，每隔30 min測定5組花色苷含量的變化。為避免溶液在加熱過程中水分蒸發而引起濃度變化，每次取樣后，標記好水位線，下次取樣測量前用相同溫度的蒸餾水將花色苷溶液補充至前一次取樣后的水位線。

色素濃度的測定采用pH示差法[29]，含量由等量矢車菊素-3-葡萄糖苷(Cyd-3-G)表示，計算公式如下：

式中：C為花色苷濃度(mg/L)；A為pH 1.0時花色苷在520 nm與700 nm的吸光值之差減去pH 4.5時花色苷在520 nm與700 nm的吸光值之差；MW為Cyd-3-G的分子量449.2 g/mol；DF為稀釋倍數；1000為將單位由g轉化為mg的倍數；ε為摩爾消光系數26900 L/(mol·cm)；1為比色皿寬度(cm)。

1.2.6 不同劑量β-環糊精對花色苷熱降解穩定性的影響

分別取0.5%、1.0%和1.5%的β-環糊精添加至玫瑰茄花色苷溶液并分別放置在80 ℃、90 ℃恒溫水浴鍋和100 ℃的恒溫油浴鍋中，避光加熱150 min，每隔30 min測定花色苷含量的變化。

1.2.7 降解動力學計算

應用一級動力學模擬不同條件下花色苷的降解[30]。動力學公式如下：

一級動力學方程：ln(Ct/C0)=-kt

式中：C0為花色苷的初始濃度（mg/mL），t為加熱時間（h），Ct為t時刻玫瑰茄花色苷的濃度（mg/mL），k為速率常數。

玫瑰茄花色苷半衰期t1/2(h)計算公式為：t1/2=ln(0.5)/k

式中：k為速率常數。

1.2.8 色澤測定

花色苷溶液的L*、a*和b*值用手持色差儀測定。其中L*值表示亮度，值越大則亮度越大；a*值表示紅色（+a*）和綠色（-a*）的程度；b*值表示黃色（+b*）和藍色（-b*）的程度。

1.2.9 數據統計分析

每組實驗重復三次，分別采用Origin軟件作圖和SPSS軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 AB-8靜態吸附曲線

通過測定溶液中原始花色苷的濃度以及經過不同時間后殘留的花色苷濃度來研究AB-8大孔樹脂對玫瑰茄花色苷的靜態吸附效果。由圖1可知，在前2 h內，AB-8大孔樹脂對花色苷的吸附速率迅速上升，隨后逐漸下降，并在3 h時趨于平衡，因此AB-8大孔樹脂的靜態吸附飽和時間約為3 h。

圖1 AB-8吸附花色苷的動力曲線Fig.1 Adsorption kinetics curve for anthocyanins on AB-8

2.2 吸附等溫線

花色苷分子中存在大量羥基，在低濃度下，花色苷在AB-8大孔吸附樹脂上是單分子層吸附，而在高濃度下花色苷也可以通過多分子層吸附[31,32]。如圖 2所示。室溫下，AB-8大孔樹脂對玫瑰茄花色苷的吸附量隨著上樣濃度增加而上升，至600 mg/L趨于飽和，故最佳的平衡花色苷濃度為600 mg/L。

圖2 25 ℃下AB-8吸附花色苷的動力曲線Fig.2 Adsorption kinetics curve for anthocyanins on AB-8 at 25 ℃

2.3 樹脂動態泄露曲線的測定

在樹脂純化過程中，常常需要通過泄漏曲線來確定所需樹脂的量、上樣體積和上樣流速[33]。當流出液的濃度達到上樣液濃度的1/10的時候，可以認為樹脂的吸附量已達到飽和，此時的上樣體積為最佳上樣體積。從圖3可以看出，樹脂對花色苷的吸附效果隨上樣液體積的增加而下降，最佳上樣體積達到183 mL。

圖3 花色苷吸附泄漏曲線Fig.3 The curve of adsorption leak of anthocyanins

2.4 乙醇濃度對解吸的影響

乙醇可作為洗脫劑減弱被吸附物質與樹脂之間吸附力的作用，使大孔樹脂溶脹而釋放出花色苷。樹脂吸附平衡以后，用酸化蒸餾水洗凈樹脂表面的多糖和蛋白等雜質，再使用不同濃度(20%、40%、60%、80%、100%)的酸化乙醇溶液進行解吸。結果如圖4所示。無論是靜態洗脫還是動態洗脫，使用60%～80%濃度的酸化乙醇的洗脫效果均為最好，考慮經濟效益和實際效果，故確定最佳解吸乙醇濃度為60%。

圖4 乙醇濃度對花色苷解析的影響Fig.4 The effect of ethanol concentration on the desorption of anthocyanin

2.5 花色苷溶液進樣流速和乙醇溶液解析流速分別對吸附和解吸效果的影響

從圖5可以看出，隨流速的增加，樹脂對花色苷的解吸效果越來越差，可能是流速過快導致乙醇不能與被吸附的花色苷充分作用而將其從樹脂上洗脫出來。但是流速太慢會導致解析的時間延長，故選擇 1 mL/min作為洗脫流速。

圖5 流速對吸附和解析的影響Fig.5 The effect of elution velocity on adsorption and desorption

2.6 純化效果分析

純化前后玫瑰茄提取物凍干粉末中花色苷濃度、蛋白質和糖濃度、色價以及花色苷回收率如表1所示，純化后，玫瑰茄花色苷的顏色更加鮮艷，其色價為43.10±2.17，約為純化前的 6倍；花色苷回收率為（83.62±5.72）%，用pH示差法測得凍干粉末中花色苷含量為216.50±2.17 mg/g，約為純化前的8倍。同時，經過純化后蛋白質和多糖的濃度顯著下降（p＜0.05），表明該方法能有效地除去雜質。這與范碧琴等人[34]在用 Sp 850樹脂對玫瑰茄花色苷純化的研究結果相似。

表1 玫瑰茄凍干粉末純化前后品質對比Table 1 Comparison of the quality of Hs freeze-dried powder before and after purification

2.7 溫度對花色苷穩定性的影響

在加熱的過程中，花色苷會發生水解或去糖基開環反應，形成查耳酮或其同分異構體α-二酮，然后降解為酚酸和醛類[35]。據報道[5]，玫瑰茄花色苷中的兩種主要成分飛燕草素-3-接骨木二糖苷、矢車菊素-3-接骨木二糖苷的降解均遵循一級反應動力學，飛燕草素-3-接骨木二糖苷對溫度升高的敏感性要明顯高于矢車菊素-3-接骨木二糖苷，它們熱降解分裂生成原兒茶酸、沒食子酸和 2,4,6-三羥基苯甲醛。本實驗主要研究添加不同穩定劑對花色苷溶液在80、90和100 ℃下熱穩定性的影響，旨為花色苷溶液的熱加工提供一種可行的方案。

表2為添加了1.0%海藻酸鈉、CMC和β-環糊精的玫瑰茄花色苷溶液在 80～100 ℃下的降解動力學參數。由圖6、7、8可知，添加不同穩定劑的三組玫瑰茄花色苷溶液在80、90和100 ℃三個溫度條件下的降解均符合一級動力學方程，推測其降解過程應屬于裂解反應，即花色苷被裂解為糖基和花色素基元兩部分[35]。這與報道文獻中黑米[36]、藍莓[37]花色苷熱降解動力學過程研究結果相吻合。

添加不同穩定劑的三種溶液中，玫瑰茄花色苷的降解速率常數均隨著溫度的升高而增大，半衰期隨著溫度的升高而減小。結果說明低溫條件下有利于玫瑰茄花色苷的穩定。在80、90和100 ℃三個溫度下添加穩定劑組的降解動力學參數均比空白組小，而且半衰期也都比空白組大。說明添加穩定劑能有效延緩花色苷的降解。這可能是因為花色苷分子被包埋在穩定劑的空腔中，在熱處理下比游離花色苷更加穩定、不易被裂解為糖基和花色素基元。

在穩定劑組內，β-環糊精組在80 ℃和90 ℃時的降解速率常數為0.1521和0.1768，顯著小于海藻酸鈉（k80℃=0.1630 和k90℃=0.1824）和（CMCk80℃=0.1655和k90℃=0.2166），說明β-環糊精在80、90 ℃下的穩定效果要優于其他兩種穩定劑。在100 ℃時，三組穩定劑的降解速率常數的大小依次為：CMC＞β-環糊精＞海藻酸鈉，海藻酸鈉的穩定效果最好，其次為β-環糊精。添加穩定劑組和空白組中，Q10隨著溫度的升高而增大（CMC例外），表明溫度高時每升高10 ℃的處理溫度會導致花色苷降解速率比溫度低條件下增加更大的比例。添加1.0%β-環糊精組花色苷Ea最大，表明此條件下花色苷發生熱降解需要能量最高，熱穩定性最好。而空白組Ea最小，熱穩定性最差，花色苷降解反應對溫度變化敏感性比較弱。綜上，選擇β-環糊精進行進一步的研究。

表2 添加穩定劑的花色苷的降解動力學參數Table 2 Degradation kinetic parameters of anthocyanins added with stabilizers

2.8 不同劑量β-環糊精對花色苷熱降解穩定性的影響

表3 添加不同濃度β-環糊精的花色苷的降解動力學參數Table 3 Degradation kinetic parameters of anthocyanins added with different concentrations of β-cyclodextrin

圖6 添加不同劑量β-環糊精對花色苷在80 ℃時降解的影響Fig.6 Effect of different dosages of β-cyclodextrin on the degradation of anthocyanins at 80 ℃

圖7 添加不同劑量β-環糊精對花色苷在90 ℃時降解的影響Fig.7 Effect of different dosages of β-cyclodextrin on the degradation of anthocyanins at 90 ℃

β-環糊精分子中間形成相對疏水的空腔，空腔尺寸各異，能選擇性地結合客體分子，有機化合物能夠部分或完全進入其空腔中而形成包埋絡合物[26]。研究表明[27]，β-環糊精與玫瑰茄花色苷發生絡合，有效地降低了花色苷的降解速率，二者結合物在加熱過程中的抗氧化性相比于游離花色苷也更穩定。由上面 2.7結論分析可知，β-環糊精具有很好的延緩花色苷降解的潛力，因此設計了三個不同的濃度梯度來進一步分析β-環糊精對花色苷熱降解穩定性的影響。如表3和圖6～8所示，在三個試驗溫度下，花色苷的降解速率常數隨著穩定劑添加量的增加而下降，半衰期隨著穩定劑添加量的增加而增加。1.5%β-環糊精在80 ℃時具有最小的降解速率常數 0.09，以及最大的半衰期7.82 h。所有β-環糊精組和空白組中，Q10隨著溫度的升高而增大，表明溫度高時每升高 10 ℃的處理溫度會導致花色苷降解速率比溫度低條件下增加更大的比例。此外，添加1.5%β-環糊精組花色苷Ea最大，表明此條件下花色苷熱穩定性最好，發生熱降解需要能量最高。同樣，空白組Ea最小，花色苷降解反應對溫度變化敏感性比較弱，熱穩定性最差。結果表明β-環糊精能有效地提高花色苷的熱穩定性，這與IOANNIS MOURTZINOS等人[27]的研究結果相似。而且隨著β-環糊精添加量從0.5%增加到1.5%，花色苷在熱處理條件下呈現出越來越穩定的趨勢。推測可能是因為β-環糊精添加量的增加提供了更多的空腔位置，有利于更多的花色苷分子與空腔的結合，進而增加了花色苷的熱穩定性。綜上，1.5%β-環糊精效果最佳。

圖8 添加不同劑量β-環糊精對花色苷在100 ℃時降解的影響Fig.8 Effect of different dosages of β-cyclodextrin on the degradation of anthocyanins at 100 ℃

2.9 色澤分析

在食品加工過程中，感官評定扮演著極其重要的角色。色澤是反應食品品質的一個重要指標。一般情況下，花色苷溶液呈現鮮紅色，高溫蒸煮后則紅色變得越來越淡，這是由花色苷本身的性質決定的。由表4可知，玫瑰茄花色苷溶液空白組的 L*、a*、b*值分別為22.78、15.76、3.60；0.5%β-環糊精組分別為38.25、18.43、4.07；1.0%β-環糊精組分別為 36.67、18.01、4.14；1.5%β-環糊精組分別為37.81、16.86、2.86。結果表明，與空白組相比，β-環糊精組具有更高的L*值（亮度）、a*值（紅度）以及更低的 b*值（黃度），并且隨著β-環糊精濃度的增加，a*值和b*值均有下降的趨勢。80 ℃下加熱150 min后，所有組的a*值變小，b*值變大，L*值也有輕微的減小。意味著加熱會降低花色苷溶液的紅度，溶液黃度增加。同時，隨著β-環糊精濃度的增加，花色苷溶液紅度下降以及黃度上升的趨勢均下降，且比空白要好，說明β-環糊精能有效維持花色苷的紅度。這與 ZUHAILI IDHAM 等人[38]的研究結果相似，該研究表明利用麥芽糊精和阿拉伯膠混合物包埋玫瑰茄花色苷時能有效地維持其a*值和b*值的穩定性。一般來說，在水溶液中玫瑰茄花色苷濃度越大則溶液的 a*值越大，β-環糊精能有效保持花色苷的a*值，說明β-環糊精能減緩花色苷的降解速率，溶液中最后剩余的花色苷的濃度越大。另一方面，b*值與溶液黃度相關，花色苷溶液熱降解會導致溶液中的b*值的上升。而隨著β-環糊精添加量的增加，b*值上升的趨勢減緩，也從另一方面證明了隨著β-環糊精添加量增加，花色苷的熱降解速率變小。結果表明，添加β-環糊精對于延緩花色苷的熱降解、維持其紅度起到重要的作用，而花色苷溶液誘人的鮮紅色能增加人們的接受度，具有重大的市場價值。

表4 加熱前后不同濃度β-環糊精的花色苷的色度變化Table 4 Color changes of anthocyanin with different concentrations of β-cyclodextrin before and after heating

3 結論

3.1 本實驗確定的AB-8樹脂分離純化玫瑰茄花色苷的最佳條件為：上樣花色苷濃度為600 mg/L，平衡3 h，上樣體積為183 mL；洗脫劑為60%乙醇，洗脫流速為1 mL/min。純化后的玫瑰茄花色苷，其色價為43.10±2.17，回收率為(83.62±5.72)%，用pH示差法測得凍干粉花色苷含量為216.50±1.83 mg/g。

3.2 在穩定性實驗中，添加1.0%海藻酸鈉、CMC和β-環糊精的三組玫瑰茄花色苷溶液在80、90和100 ℃三個溫度下的降解均符合一級動力學方程，降解速率常數均隨著溫度的升高而增大，半衰期隨著溫度的升高而減小。β-環糊精具有很好的延緩花色苷降解的潛力，在0.5%、1.0%和1.5%β-環糊精組中，均表現為溫度越高，花色苷的降解速率越大，而隨著β-環糊精添加濃度的增加，花色苷的降解速率越小。80 ℃下加熱150 min后，β-環糊精組和空白組a*值均變小，b*值變大，L*值也有輕微的減小。β-環糊精能有效維持花色苷的紅度，隨著β-環糊精濃度的增加，花色苷溶液紅度的下降以及黃度的上升趨勢均下降，在三個濃度中1.5%β-環糊精組的護色效果最佳。根據本實驗的結果，在花色苷溶液加熱過程中可適量添加穩定劑，既可以起到增稠、改善口感的作用，又能增強花色苷的熱穩定性。添加了穩定劑的花色苷溶液既可以直接作為食品原料加工成飲料又可以作為配料添加到其他食品中，還可以直接通過噴霧干燥生產色素粉末。