竹節參總皂苷通過激活自噬抑制衰老大鼠心肌細胞凋亡

王烙佩，鄭杰，李思敏，張長城，王婷，袁丁，周志勇

（1.三峽大學醫學院，湖北宜昌 443002）(2.三峽大學附屬仁和醫院，湖北宜昌 443001）

心血管疾病已成為全世界第一位致死、致殘原因，年齡是心血管疾病發展的重要危險因素，統計顯示，50歲以上人群心血管疾病發病率顯著升高，其發病形式多樣，包括外周血管病變、冠狀動脈疾病、心力衰竭、血脂異常和高血壓等[1,2]。且大量研究結果表明，衰老心臟呈現獨特的組織學和生物化學特征，主要包括心肌細胞壞死增多，核增值、體積變大，結締組織聚集，心肌細胞凋亡數量增多[3]，心肌纖維化程度加重，并伴有心臟舒張功能降低和心率失常增加等風險[4]。近期研究表明，自噬活性與心肌細胞凋亡密切相關，自噬增強能有效減輕左旋硝基精氨酸誘導高血壓所致的心肌損傷，減輕心肌細胞凋亡[5]。且抑制自噬，加劇烏頭堿誘導的心肌細胞凋亡[6]。

竹節參系五加科人參屬植物竹節參（Panax japonicusC. A. Mey.）的干燥根莖，其主要化學成分為竹節參總皂苷（total saponins ofPanax japonicas，TSPJ），具有補虛強壯，散瘀止血、止痛的功效，多用于素體嬴弱，跌撲損傷，咳嗽咯血以及痰多[7,8]，在我國少數民族土苗聚居地廣泛使用，在土家族稱為“草藥之王”，具有極高的藥用價值，近幾年成為研究和探索的熱點。我們課題組前期研究證實，TSPJ具有良好的心臟保護作用，能有效減輕缺血導致的心肌損傷，恢復心功能，并可顯著抑制急性缺血、心梗導致的心肌細胞凋亡[9]。近期研究顯示，TSPJ能有效改善衰老大鼠心肌形態，減輕心肌纖維化，抑制H9c2大鼠心肌細胞中促凋亡蛋白 Bax的活性，促進抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的活性、提高Bcl-2/Bax的比值，有效改善心肌細胞凋亡[10]。體外研究也發現，竹節參總皂苷對H2O2所致心肌細胞損傷具有保護作用，可有效抑制心肌細胞凋亡[11]。但竹節參總皂苷改善衰老大鼠心肌細胞凋亡的確切機制目前尚不完全明確。本研究將利用自然衰老模型大鼠，從心肌細胞自噬方面探討竹節參總皂苷對自然衰老大鼠心肌細胞凋亡的保護作用及其可能的機制，為臨床應用提供實驗依據和理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 動物及飼料

SPF級Sprague-Dawley雄性大鼠40只購自三峽大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（鄂）2011-0012。動物飼養于溫度為20～23 ℃，濕度為55%～65%，12 h明暗交替的飼養室。自由攝食和飲水，并定期更換消毒墊料。

1.1.2 藥物及試劑

竹節參藥材采購自恩施州椿木營，經三峽大學生藥學專家何毓敏博士鑒定為正品竹節參。TSPJ由本研究團隊提取分離，其提取率為23%。以竹節參Ⅳa標準品為對照品，香草醛-高氯酸顯色后采用紫外分光光度法測得TSPJ的相對純度為80.3%[12]。BCA蛋白濃度定量試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司；Tunel-細胞凋亡原位檢測試劑盒(10768100)，德國Roche公司；Bax（sc-7480）購自美國Santa Cruze公司；Bcl-2（#625509）購自美國R&D Systems公司；Caspase-3（ab44976）、Caspase-9（ab52298）、p62（ab56416）、Beclin1（ab207612）購自美國Abcam公司；LC3Ⅰ /Ⅱ( # 12741)購自美國cell signaling公司；GAPDH(#5174)購自美國Cell Signaling公司；辣根過氧化酶標記的兔抗山羊（111004）、山羊抗兔（125510）均購自武漢科瑞生物技術有限公司。BCA蛋白濃度定量試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司；Bax（sc-7480）購自美國Santa Cruze公司；Bcl-2（#625509）購自美國R & D Systems公司；Caspase-3（ab44976）、Caspase-9（ab52298）、p62（ab56416）、Beclin1（ab207612）購自美國Abcam公司；LC3Ⅰ /Ⅱ(#12741)購自美國cell signaling公司；GAPDH(#5174)購自美國Cell Signaling公司。辣根過氧化酶標記的兔抗山羊（111004）、山羊抗兔（125510）均購自武漢科瑞生物技術有限公司。

1.1.3 主要儀器

IX53型光學倒置顯微鏡，日本 Olympus公司；LEICA EG 1150H型石蠟包埋機、LEICA TP 1020型自動脫水機、LEICA EG 1150C型超薄切片機，德國Leica公司；Power Pac TM Basic電泳儀，美國Bio-Rad公司；Bioshine Chemi Q 4800化學發光凝膠成像自動顯影儀，上海歐翔科學儀器有限公司；JA2003電子分析天平，上海天平儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及給藥

將30只18月齡SD雄性大鼠隨機分為衰老模型組、TSPJ低劑量組、TSPJ高劑量組。衰老模型組給予等量正常飼料，TSPJ低、高劑量組分別投食給予TSPJ 10 mg/(kg·d)、30 mg/(kg·d)，連續給藥 6 個月至24月齡，每天1次。另取10只6月齡大鼠做青年對照組。動物處理前一晚禁食不禁水，第二天腹腔注射20%烏拉坦5 mL/kg待麻醉后，腹主動脈取血并快速取出心臟組織，用預冷的生理鹽水洗凈擦干后，存儲于-80 ℃冰箱以備使用。

1.2.2 大鼠心臟組織HE染色

待大鼠麻醉后腹主動脈取血，快速取出心臟組織，經生理鹽水沖洗后，沿垂直于縱軸中間靠心尖的位置將心臟切割成2～3 cm厚的組織塊，多聚甲醛固定24 h后，再用75%乙醇再放置24 h。經脫水機梯度酒精脫水，二甲苯透明、石蠟包埋，切片。根據HE染色步驟先經二甲苯脫蠟，不同濃度酒精復水（由高到低），放入雙蒸水中，蘇木精染核和伊紅染色后，再梯度酒精脫水、二甲苯透明，最后將組織置于通風處待殘留的甲苯揮發干凈后，滴加中性樹膠封片。待片子略干后，于倒置光學顯微鏡下仔細觀察大鼠心臟組織形態變化，并在不同視野隨機取圖。

1.2.3 Tunel試劑盒檢測大鼠心肌細胞凋亡

石蠟切片經常規脫蠟脫苯入水處理后，按照Tunel細胞凋亡原位檢測試劑盒的操作步驟染色，光鏡觀察，正常心肌細胞核呈藍色，凋亡心肌細胞核呈棕褐色。于200倍的光鏡下每張切片隨機選擇2～3個視野，計算每個視野中凋亡細胞核數和總細胞核數，計算心肌細胞凋亡指數。凋亡指數=凋亡細胞核數/總細胞核數×100%。

1.2.4 Western blot檢測大鼠心臟組織中相關蛋白的表達

-80 ℃取組織樣本，稱取心臟組織約40 mg，各組加入約500 μL裂解液，用勻漿機研磨，靜置、離心后，吸取上清液。用BCA法蛋白定量。蛋白變性后，SDS-PAGE跑膠，先80 V恒壓約30 min后，110 V恒壓電泳直至 Marker條帶完全跑開；切下所需目的條帶，250 mA恒流轉膜100 min。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗4 ℃過夜；洗滌一抗后，加入相應標記的二抗，再清洗二抗，室溫孵育1 h，加入ECL顯影液顯色。

1.2.5 統計學處理

采用GraphPad Prism 5、Image J軟件進行統計分析，實驗數據采用均數±標準差（±sd）表示。采用單因素方差分析法比較各組間差異的顯著性，p＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 竹節參總皂苷對衰老大鼠心臟組織形態學的影響

光鏡可見青年對照組中大鼠心肌纖維排列整齊緊湊，結構清晰，心肌細胞形態形態、胞質及間質均正常；與青年對照組相比，自然衰老模型組中大鼠心肌細胞排列紊亂，細胞間隙增大，心肌細胞變性增多，間質纖維增生，肌纖維斷裂。與 24月齡相比，TSPJ低、高劑量組大鼠心肌纖維形態得到明顯改善，纖維排列整齊，心肌細胞炎性浸潤減輕，間質纖維增生減少。結果如圖1所示。

圖1 各組大鼠心肌組織病理形態學改變(×200)Fig.1 Pathologic changes of myocardium tissues of rats in each group (×200)

2.2 TSPJ 對衰老大鼠心肌細胞凋亡的影響

圖2 竹節參總皂苷對衰老大鼠心肌細胞凋亡的影響（×200）Fig.2 The cardiomyocyte apoptosis of each group (×200)

Tunel法的原理是細胞凋亡過程中基因組DNA發生斷裂，脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)可催化標記這些DNA鏈斷裂和缺口處的3'-OH末端，進行后續識別，將正常細胞核染成藍色，凋亡陽性細胞核染成棕褐色。結果顯示，與6月齡相比，24月齡大鼠細胞凋亡數顯著增加；而 TSPJ干預后心肌細胞凋亡數量明顯減少，見圖2。統計結果表明，與6月齡大鼠相比較，24月齡大鼠的心肌凋亡指數上升3倍；與24月齡大鼠比較，TSPJ低、高劑量組大鼠的凋亡指數分別降低49%和55%，如圖2所示。

2.3 TSPJ對衰老大鼠心臟組織 Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達的影響

圖3 各組大鼠心臟組織中Caspase-3和Caspase-9蛋白表達的變化Fig.3 The protein expression of Caspase-3 and Caspase-9 in the cardiac tissues of each group

圖4 各組大鼠心臟組織中Bcl-2、Bcl-2/Bax、Bax蛋白表達量的變化Fig.4 The protein expression of Bcl-2、Bcl-2/Bax and Bax in the cardiac tissues of each group

隨著年齡增長，心臟的收縮舒張功能逐漸衰退、僵硬度增加、順應性降低，并伴隨著心肌細胞凋亡增加、氧化應激及自噬功能障礙等，最終導致心血管疾病的發生。由死亡受體和線粒體細胞色素C途徑介導，經過一系列級聯反應激活 Caspase家族（cysteiny laspartate specific proteinase）最終導致細胞凋亡。凋亡抑制基因Bcl-2可調節線粒體膜通透性，以阻止細胞色素C釋放進入胞質，且對下游Caspase也有抑制作用，從而減少細胞凋亡。Bax與Bcl-2為同源分子，但其功能相反，是促細胞凋亡的代表[13,14]。Western Blot結果顯示，與6月齡相比，24月齡組大鼠心臟中Bax、Caspase-3和 Caspase-9的蛋白表達量分別提高了9.5倍，1.8倍和4.1倍，Bcl-2蛋白表達量及Bcl-2/Bax比值下降98%和99%，給予TSPJ干預后，與24月齡大鼠相比，TSPJ低劑量組中Bax蛋白水平下降87%，Bcl-2的表達以及 Bcl-2/Bax比值分別上升 6.5倍和19.75倍；竹節參高劑量組中Bax、Caspase-3、Caspase-9分別下調87%、65%、70%，Bcl-2的表達以及Bcl-2/Bax比值分別升高了12.75倍和138.5倍。Tunel和Western blot結果顯示，TSPJ能有效干預自然衰老過程中心肌細胞凋亡指數以及促凋亡蛋白Bax和Caspase3等蛋白的表達，提高Bcl-2蛋白表達和Bcl-2/Bax比值。說明大鼠心臟組織在衰老過程中心肌細胞凋亡增多，而TSPJ能顯著改善自然衰老大鼠的心肌細胞凋亡，且呈劑量依賴性。如圖3、4所示。

2.4 TSPJ對衰老大鼠心臟組織 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62和Beclin1蛋白表達的影響

自噬誘導細胞發生凋亡抵抗，當細胞自噬受阻，凋亡進程明顯加速[15]。而自噬功能障礙是心臟衰老的重要特征之一，心肌細胞終末分化的特性使得難以清除細胞內受損的大分子和細胞器，導致細胞穩態下降[16]。增強自噬活性有助于心肌細胞存活，并在對嚴重損傷（如心肌梗死、缺血和暴露于晚期糖基化終末產物）的反應時，可保護心臟免受病理性重塑和功能障礙[17]。有研究表明，自噬相關基因ATG5敲除小鼠在衰老過程中會發展為擴張型心肌病，并伴有嚴重的收縮功能障礙[18]；長期服用自噬激活劑雷帕霉素可以延長小鼠的壽命[19]。本實驗結果也顯示，與6月齡大鼠青年對照組比較，24月齡自然衰老組大鼠中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和 Beclin1蛋白表達水平分別下降了70%和48%，p62表達顯著增加3.4倍，而TSPJ低劑量組衰老大鼠心臟組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1表達分別升高了5.68倍和2.6倍，p62表達減少了57%；竹節參高劑量組衰老大鼠心臟組織中 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1表達分別升高了5.68倍和2.6倍，p62表達減少了65%。從Western Blot結果顯示，TSPJ能有效提高自然衰老過程中心肌細胞自噬相關蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1表達，減少p62表達。說明大鼠心臟組織在衰老過程中自噬能力下降，而 TSPJ能顯著增強自噬從而保護衰老大鼠心臟組織，如圖5所示。

圖5 各組大鼠心臟組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62、Beclin1蛋白表達的變化Fig.5 The protein expression of LC3Ⅱ/LC3Ⅰ, p62, Beclin1 inthe cardiac tissues of each group

3 結論

3.1 HE和Tunel染色結果顯示衰老大鼠心臟組織中心肌纖維排列疏松紊亂，心肌細胞變性，間質纖維增生，心肌細胞凋亡指數上調3倍。經TSPJ干預后，自然衰老大鼠心肌形態得到明顯改善，纖維排列整齊，心肌細胞炎性浸潤減輕，間質纖維增生減少，低、高劑量竹節參組心肌細胞凋亡指數分別下降 49%和55%。Western Blot結果也顯示在衰老過程中，促凋亡相關蛋白Bax、Caspase-3和Caspase-9表達水平分別增加9.5倍、1.8倍和4.1倍，p62表達顯著增加3.4倍，抑凋亡蛋白Bcl-2表達和Bcl-2/Bax比值分別下降98%和99%，且自噬相關蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白表達水平分別下降了70%和48%；與24月齡衰老大鼠相比，TSPJ能激活自噬且抑制大鼠在自然衰老過程中凋亡相關蛋白表達水平。在TSPJ低劑量組中，促凋亡蛋白Bax和P62分別下降了87%和57%，抑凋亡蛋白 Bcl-2、Bcl-2/Bax比值及自噬相關蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1分別上調6.5倍、19.75倍、5.68倍、2.6倍；TSPJ高劑量組促凋亡蛋白Bax、Caspase3、Caspase9和p62分別下調87%、65%、70%和65%，Bcl-2、Bcl-2 /Bax比值、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1表達分別升高了12.75倍、138.5倍、5.68倍、2.6倍。

3.2 本研究的結果證實了在衰老大鼠模型中，心肌細胞自噬活性下降，凋亡指數增高，經竹節參總皂苷干預后，凋亡指數明顯下降，上調 Bcl-2蛋白，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和 Beclin1表達量，下調凋亡相關蛋白Bax、Caspase3、Caspase9和p62表達量。因此我們得出結論：竹節參總皂苷對自然衰老大鼠心臟具有較好的保護作用，其機制可能是通過激活自噬過程，抑制心肌細胞凋亡，本研究為進一步闡明竹節參總皂苷延緩衰老作用提供實驗室基礎。