大分子擁擠對脂肪干細胞增殖及其成骨分化能力的影響

耿英楠 韋敏 毛豪麗

微環境對細胞的增殖和分化具有重要作用。在人體內部，細胞被微環境包圍，微環境擠滿了可溶性因子、其他細胞和細胞外基質，其中大分子血漿蛋白在細胞質中的濃度達200～350 g/L[1]；另外，大腸桿菌內蛋白質和核糖核酸的總質量濃度達300～400 g/L。這些大分子占據了細胞近40%的體積[2]。

大分子擁擠試劑通過發揮 “排斥容積效應（EVE）”而達到改善微環境的作用，可促進細胞外基質的形成和重塑[3]。“排斥容積效應”強調源于空間排斥的純物理非特異性效應，很多大分子占據一定的體積，形成“部分體積占用（FVO）”，不被其他分子利用，從而形成一個高濃度的大分子微環境[2]。研究證明，大分子擁擠環境有助于干細胞在體外形成自己的基質微環境，并影響了許多基本原理，例如酶反應速率、細胞骨架的形成、細胞黏附和遷移等[4]。

以往的研究多是利用胎牛血清培養的骨髓間充質干細胞或成纖維細胞研究大分子擁擠試劑對細胞行為的影響[5]。脂肪干細胞（ADSCs）來源豐富、易獲取，成為當前干細胞領域的研究熱點。ADSCs具有多向分化能力，并且免疫原性和免疫調節特性均較低[6]，被越來越多地應用于骨組織再生的相關研究中[7]。在再生醫學研究中，細胞外基質富含糖蛋白、蛋白聚糖和黏多糖等，支持細胞的黏附，并作為細胞生長的源泉，為其再生提供豐富的條件[2]；另外，大分子擁擠環境對細胞外基質成分中的膠原蛋白、糖胺聚糖、生長因子等都會產生影響。因此，本研究嘗試探索大分子擁擠環境對ADSCs成骨分化能力的影響，以及大分子擁擠試劑的最佳使用時間及其對ADSCs增殖能力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

脂肪來源于抽脂患者（18～40歲），均獲患者知情同意。

低糖 DMEM（Hyclone，USA），胎牛血清（Gibco，Australia），地塞米松、維生素 C、β-磷酸甘油鈉（AmreSCO，USA），CCK-8 試劑盒（Dojindo，Japan），dsDNA核酸定量分析試劑盒（Quant-iTTMPicoGreenR，Invitrogen，USA），BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術公司），茜素紅染液（上海索萊寶生物科技有限公司），膠原酶Ⅳ型（Sigma-C-5138，上海玉博生物科技有限公司），Ficoll 400和Ficoll 70（GE Healthcare Bio-Science，Sweden）。

1.2 實驗方法

1.2.1 ADSCs提取

將抽脂獲取的脂肪組織用無菌PBS沖洗干凈，加入用培養液配制好的等體積濃度（1%）的Ⅳ型膠原酶，37℃振蕩消化60～90 min。脂肪消化完全至乳糜狀后，1 500 r/min離心5 min，棄上層液體，加完全培養液重懸，1 500 r/min離心5 min，最后加入適量完全培養液重懸均勻，接種于培養皿，置37℃、5%CO2培養箱中培養。以第3代ADSCs用于后續實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測大分子擁擠對ADSCs增殖能力的影響

將第3代ADSCs以3 000個/孔的密度接種于96孔板，培養第2天，實驗組每孔加入50 mg/mL無菌的Fc混合液（含25 mg/mL Ficoll 400和37.5 mg/mL Ficoll 70）100 μL；不加 Fc混合液的則為對照組。加入Fc混合液的第2天記為 D1，分別于D1、D2、D3、D7、D10，采用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖能力。

1.2.3 dsDNA核酸定量和BCA蛋白濃度測定檢測大分子擁擠對ADSCs的DNA及蛋白質合成的作用

將第3代ADSCs以 1×105個/孔的密度接種于6孔板，待第2天細胞長滿達80%左右，實驗組培養液換為Fc混合液，對照組依舊用低糖DMEM換液。換成Fc混合液的第2天記為D1，分別于D3、D7用dsDNA定量試劑盒檢測ADSCs的DNA含量，用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測細胞的蛋白質含量。檢測均按照試劑盒說明書步驟進行操作。

1.2.4 大分子擁擠環境對ADSCs成骨分化能力的影響

將第3代ADSCs以 1×105個/孔的密度接種于6孔板，待第2天細胞長滿達80%左右，分為4組：①對照組，只加入成骨誘導液；②實驗組1，在加入Fc混合液同時，加入成骨誘導培養液；③實驗組2，加入Fc混合液3 d后加入成骨誘導培養液；④實驗組3，加入Fc混合液3 d后加入成骨誘導培養液。各組均置于37℃、5%CO2培養箱中培養，每隔2～3 d換液。待成骨誘導至第14天時，1%茜素紅染色，觀察鈣結節沉積情況。

1.3 統計學分析

數據統計采用GraphPad Prism軟件（Version 5.00，GraphPad Software，USA），數據以（x±s）表示。組間比較采用非配對t檢驗，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 大分子擁擠對ADSCs增殖能力的影響

CCK－8法檢測顯示，對照組和實驗組ADSCs增殖均在第7天達到頂點，但實驗組顯著高于對照組（P＜0.05）（圖 1）。

圖1 ADSCs增長曲線Fig.1 Growth curves of ADSCs

2.2 dsDNA核酸定量和BCA蛋白濃度測定結果

結果顯示，D3、D7實驗組ADSCs的DNA和蛋白質含量均高于對照組，差異顯著（P＜0.05）（圖 2）。

圖2 對照組和實驗組各時間點ADSCs的DNA和蛋白質含量Fig.2 DNA and protein contents of ADSCs in the experimental and control groups at different time points

2.3 對成骨誘導的影響

成骨誘導第14天，細胞表面失去透光性，可見顆粒狀鈣鹽沉積，形成鈣化結節。茜素紅染色結果顯示，實驗組細胞間出現多個致密、圓形的深染紅色團塊，呈現明顯的陽性反應；對照組即未成骨誘導組染色陰性；3個實驗組中，實驗組1（Fc混合液與成骨誘導液同步加入）的鈣結節染色最深，鈣結節更多，細胞間出現大量致密圓形的深紅色團塊（圖3）。

圖3 成骨誘導培養的ADSCs茜素紅染色（40×）Fig.3 Alizarin red staining of ADSCs after osteogenic induction(40×)

3 討論

研究表明，大分子擁擠環境能以數量級的方式促進細胞的熱力學過程和生物活性，從而優化細胞的微環境，并有助于穩定培養細胞或促進分化[8]。本研究證實，大分子擁擠試劑所產生的微環境促進了ADSCs的DNA和蛋白質含量的增加，對細胞的增殖具有明顯的促進作用。本研究結果顯示，Fc混合液與成骨誘導液同時使用時，ADSCs的成骨分化能力最佳，可能與大分子擁擠試劑所占的FVO產生的EVE有關。FVO是用來評估擁擠程度的一個重要參數[9]，理想情況下，應該選擇與所培養的細胞類型的自然環境相對應的FVO。本研究中使用的Ficoll 400和Ficoll 70均為不帶電荷分子，混合形成的Fc混合液的FVO為17%左右[2]，與ADSCs的自然環境較符合，能促進ADSCs的增殖和分化。

大分子擁擠劑可通過EVE效應產生一些物理變化來增加細胞外基質中膠原含量和其他一些重要成分，如糖胺聚糖、生長因子等。我們認為，這種大分子擁擠試劑在組織工程與再生醫學研究中將具有很大的潛在應用價值。目前，大分子擁擠在骨組織工程中的應用尚不多見，今后我們將會通過體內實驗和更深入的體外實驗，驗證大分子擁擠環境在骨再生醫學中的應用價值，為相關研究提供更好的思路和方法。